Camptothecin

拓扑异构酶I裂解复合物实验

从小牛胸腺中分离拓扑异构酶I（不含扑异构酶II）。在酶标板上，所有反应均在10 mL反应缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，100 mM KCl，0.5 mM EDTA和30 μg/mL BSA)中进行。将Camptothecin 溶于DMSO，使其浓度达10 mg/mL，在96孔板上连续稀释，加入末端具有32P标记的pBR322 DNA和拓扑异构酶。在室温下，将反应混合物孵育30分钟，然后加入2 mL十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的混合物（终浓度分别为1.6%和0.14 mg/mL）终止反应。在50°C下，将96孔板加热30分钟，加入10 mL含0.45 N NaOH的标准液终止反应，从而获得单链DNA。在TBE缓冲液中，使用1.5%琼脂糖凝胶对样本进行电泳。将凝胶印到硝酸纤维素纸，烘干，将其暴露于X-射线胶片。通过放射自显影并绘制的药物浓度图（log）计算裂解单位数目。获得IC50值。

细胞系

HCT116和RKO结肠直肠癌（CRC）细胞

制备方法

在DMSO中的溶解度受限。若配制更高浓度的溶液，一般步骤如下：请将试管置于37℃加热10分钟和/或将其置于超声波浴中震荡一段时间。原液于-20℃可放置数月。

反应条件

20和50 nM；72小时

实验结果

对于HCT116和RKO CRC细胞，CPT的低剂量分别为20 nM和50 nM，两者均能引起最小可检测的细胞死亡。低剂量的Camptothecin分别通过AMPK-TSC2-mTOR途径和ATM-Chk2-p53-p21途径诱导细胞自噬以及早衰。

动物模型

携带CASE、SW48、DOY、SPA和CLO细胞异种移植瘤的裸鼠

给药剂量

0 ~ 8 mg/kg；肌肉注射或静脉注射；每周两次

实验结果

在携带多种异种移植瘤（如：结肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌和卵巢癌）的小鼠中，Camptothecin（8 mg/kg）完全抑制肿瘤生长以及引起肿瘤衰退

其他注意事项

请于室内测试所有化合物的溶解度。虽然化合物的实际溶解度可能与其理论值略有不同，但仍处于实验系统误差的允许范围内。

References:

[1]. Luzzio MJ, Besterman JM, Emerson DL, Evans MG, Lackey K, Leitner PL, McIntyre G, Morton B, Myers PL, Peel M, et al. Synthesis and antitumor activity of novel water soluble derivatives of camptothecin as specific inhibitors of topoisomerase I. J Med Chem. 1995 Feb 3;38(3):395-401.

[2]. Zhang JW, Zhang SS, Song JR, Sun K, Zong C, Zhao QD, Liu WT, Li R, Wu MC, Wei LX. Autophagy inhibition switches low-dose camptothecin-induced premature senescence to apoptosis in human colorectal cancer cells. Biochem Pharmacol. 2014 May 22. pii: S0006-2952(14)00286-X.

[3] Giovanella BC, Hinz HR, Kozielski AJ, Stehlin JS Jr, Silber R, Potmesil M. Complete growth inhibition of human cancer xenografts in nude mice by treatment with 20-(S)-camptothecin. Cancer Res. 1991 Jun 1;51(11):3052-5.