浙江大学谢杰团队在2024年12月30日于《Journal of Extracellular Vesicles》发表了题为“_{Fused extracellular vesicles from M2 macrophages and human umbilical cord mesenchymal stem cells for the targeted regulation of macrophage pyroptosis in periprosthetic osteolysis}”的研究文章。该研究聚焦于开发预防和治疗假体无菌松动的策略，特别是通过工程化融合来自M₂巨噬细胞和人类脐带间充质干细胞的细胞外囊泡（fEV），以精确抑制由磨损颗粒引发的局部巨噬细胞焦亡。这些fEV具备靶向运输和免疫逃避的独特能力，能够增强治疗性细胞外囊泡的抗焦亡效果，显示出对假体周围骨溶解具有显著的预防和治疗潜力，从而突出了其在临床应用中的重要性和前景，为设计和开发针对性细胞外囊泡基础药物递送系统开辟了新范式。其中APExBIO的染料法qPCR系列产品HotStart™ 2X Green qPCR Master Mix（Catalog No. K1070）以其优越的特异性和扩增效率助力本研究成果。

研究背景

随着人口老龄化，关节置换需求增加，无菌性假体松动（APL）成为关节置换后最严重的并发症，导致假体松动。APL主要由于人工关节磨损颗粒引发的假体周围骨溶解，但具体机制尚不完全清楚。磨损颗粒引发无菌炎症反应，激活RANK信号通路，导致破骨细胞激活和骨溶解。NLRP3炎症体的激活和IL-1β的释放是APL病理过程中的关键因素，但抑制磨损颗粒诱导的巨噬细胞焦亡以减轻骨溶解的机制尚未完全探索。人类脐带间充质干细胞（hucMSC）及其衍生的小细胞外囊泡（hucMSC-EV）可能对抗巨噬细胞焦亡，但需要解决靶向递送和维持治疗浓度的挑战。研究提出了使用M₂巨噬细胞衍生的细胞外囊泡（M₂-EV）将hucMSC-EV递送到假体周围的炎症区域，以抑制巨噬细胞焦亡，为预防和治疗假体周围骨溶解提供新策略。

主要结论

研究结果一：针对炎症和焦亡的治疗策略可能有助于预防和治疗假体周围骨溶解

本研究通过比较因股骨颈骨折接受初次全髋关节置换的患者和经历无菌髋假体松动导致假体周围骨溶解患者的滑膜（SM）组织与假体周围膜（PM）组织，揭示了PM组织在组织结构和炎症细胞浸润方面与SM组织存在显著差异。PM组织显示出更加紊乱的组织结构和更明显的炎症细胞浸润，这些特征与假体周围骨溶解的病理变化相关。此外，研究还发现PM组织中焦亡相关蛋白GSDMD和炎症因子IL-1β的表达水平显著高于SM组织，表明焦亡和炎症反应在假体周围骨溶解的病理过程中可能发挥重要作用。

研究结果二：fEV的成功制备和鉴定特征

_{通过构建由M2型巨噬细胞衍生的EVs（M2-EV）和人脐带间充质干细胞衍生的EVs（hucMSC-EV）融合而成的融合细胞外囊泡（fEV），以实现治疗性EVs对假体周围骨溶解区域的靶向递送。}研究中，通过IL-4和IL-13诱导BMDM获得M₂型巨噬细胞，并收集M₂型巨噬细胞和hucMSC培养的上清液，使用超高速离心方法分离EVs构建fEV。通过流式细胞术分析和透射电子显微镜观察，确认了fEV的成功制备和其独特的结构特征。fEV的平均粒径约为50纳米，且具有典型的sEV特性，如表达CD63和TSG101蛋白。此外，fEV在蛋白组成上保留了M₂-EV和hucMSC-EV的特性。通过激光共聚焦扫描显微镜直接观察到fEV的融合，证实了fEV的成功制备。

研究结果三：fEV在体外抑制了巨噬细胞的焦亡

研究显示，融合细胞外囊泡（fEV）在体外对巨噬细胞焦亡具有显著的抑制效果。通过CCK-8实验验证了fEV对巨噬细胞的安全性后，研究人员使用活死染色和LDH释放实验来评估fEV对Ti颗粒诱导的细胞死亡的影响。结果显示，fEV和混合EV能够显著逆转Ti颗粒引起的细胞死亡，而单独的M₂-EV和hucMSC-EV效果不显著。此外，fEV和混合EV干预减少了ASC斑点的形成和组装，这是焦亡的启动信号。WB分析表明，fEV和混合EV干预降低了焦亡调节分子的水平，包括caspase-1 p20、GSDMD-NT和IL-1β p17。共免疫沉淀实验进一步证实了fEV对ASC和caspase-1结合的影响，与混合EV组相比，fEV显示出最少的ASC-caspase1结合，导致最低的细胞焦亡水平。细胞上清液中焦亡相关因子的分析显示，fEV和混合EV治疗显著降低了LPS+Ti干预引起的IL-1β和IL-18水平升高，表明它们减轻了细胞焦亡。

研究结果四：fEV在体外实验中能有效抑制巨噬细胞向成骨细胞的分化和成熟

_{研究发现，fEV能够显著降低RANKL诱导的巨噬细胞产生的活性氧（ROS），这一效果优于单独使用M2-EV或hucMSC-EV。}通过TRAP染色观察到，fEV和混合EV能有效地减少成骨细胞的数量。此外，fEV处理的成骨细胞足突排列呈现出分散状态，与RANKL诱导的成骨细胞形成鲜明对比。在分子水平上，fEV显著降低了NFATc-1、TRAP和Cathepsin-K蛋白的表达，并下调了MMP9、OSCAR和NFATc-1的mRNA水平。

实验结果表明，fEV能够促进hBMSC在成骨过程中的ALP表达、钙结节形成和胶原沉积，这些是成骨分化的关键指标。与单独使用M₂-EV或hucMSC-EV相比，fEV和混合EV的处理进一步增强了这些效应，表明fEV在促进hBMSC成骨分化方面具有潜在的增强效果。定量分析和WB分析的结果进一步证实了fEV在促进hBMSC成骨分化中的作用。

研究结果五：fEV能够提高治疗分子的靶向性和体内循环时间

本研究部分探讨了融合细胞外囊泡（fEV）在体内靶向骨溶解区域的能力，特别是在假体周围的骨溶解。通过使用DiR荧光染料标记fEV，并在老鼠模型中进行尾静脉注射，研究者能够在不同时间点监测fEV在颅骨区域的分布和富集情况。结果显示，与单独的hucMSC-EV或混合EV相比，fEV在骨溶解区域的荧光强度显著增强，表明fEV能更有效地靶向骨溶解区域。此外，fEV在体内的循环时间比单独的hucMSC-EV更长，这可能与其在肝脏和脾脏中较高的荧光信号残留有关。

研究结果六：融合细胞外囊泡（fEV）对假体周围骨溶解的预防和治疗效果

本研究部分评估了融合细胞外囊泡（fEV）在体内对假体周围骨溶解的预防效果。通过Micro-CT扫描和H&E染色，研究者观察到fEV能够显著抑制由钛颗粒引起的骨溶解，表现为骨体积/总体积比的减少和骨表面积/骨体积比的增加。与单独的hucMSC-EV或M₂-EV相比，fEV在抑制骨溶解方面更为有效，这归因于其增强的靶向能力和治疗效果。fEV的干预还改善了由钛颗粒引起的炎症反应，恢复了骨组织的正常形态，并减少了炎症性骨膜的厚度。此外，fEV显著减少了破骨细胞的形成，降低了骨吸收活动，并增强了成骨分化相关蛋白RUNX2的表达，从而促进了骨形成和修复。这些结果表明，fEV作为一种潜在的治疗手段，不仅能够有效抑制骨溶解，还能促进骨组织的修复和再生。

研究结果七：针对假体周围骨溶解中巨噬细胞焦亡的靶向抑制

最后，我们研究了融合细胞外囊泡（fEV）对体内由钛颗粒诱导的骨溶解区域中巨噬细胞焦亡水平的影响，同时也评估了焦亡执行蛋白GSDMD和焦亡因子IL-1β在骨溶解区域的表达水平（图9）。免疫荧光分析显示，在钛颗粒处理下，骨溶解区域的GSDMD和IL-1β表达显著上调。然而，与fEV组相比，单独的M₂-EV或hucMSC-EV由于缺乏治疗效果或靶向能力，未能逆转这一过程。与混合EV组相比，fEV组在钛颗粒诱导的GSDMD和IL-1β表达上显示出明显的降低，表明fEV具有更优越的巨噬细胞调节能力。这些发现强调了fEV靶向减轻由钛颗粒诱导的骨溶解区域中巨噬细胞焦亡水平的能力。

总结

_{本研究成功开发了一种融合细胞外囊泡平台，通过M2-EV传递hucMSC-EV，以实现体内靶向传递。}fEV在预防和治疗假体周围由磨损颗粒引起的骨溶解方面显示出潜力，但研究存在局限性，包括使用LPS诱导NLRP3转录以模拟焦亡，而其他研究使用不同的方法。研究计划深入探索焦亡机制，以找到更好的模型，并计划通过转录组或蛋白质组分析来验证fEV的生物学功能和精确分子靶标。在fEV的临床应用之前，需要解决包括验证其在人体中的效果、考虑免疫排斥和伦理问题、评估长期安全性、开发标准化制备流程和降低成本策略，以及设计整合fEV的人工关节假体。这些挑战的解决将推动fEV在临床的应用，并为细胞外囊泡在医疗实践中的应用提供新见解。

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