1. TEV酶可用于哪些融合蛋白的标签肽？

答：可用于含His，GST，MBP，SUMO和GFP等标签的融合蛋白中。

2. 识别序列信息是什么？

答：Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly，在Gln与Gly之间切割。 然而，P1’位置的氨基酸（Gly）也可以是Gly、Ala、Met、Cys和His。

3. TEV酶反应条件和酶失活条件是什么？

答：反应条件-在宽温度范围（4°C-30°C，最适温度30℃）和 pH 值范围（6.0-8.5）内具有活性。失活条件-65℃，加热 20 min 可使酶失活。为了最大限度地提高蛋白质活性和保留结构特点，裂解反应建议在4°C下过夜进行。

4. TEV酶切反应中，哪些因素会影响酶切反应？

答：如果融合蛋白样品含有变性剂（＞2 M尿素和＞0.5 M氯化胍）、组氨酸残基类似物（＞50 mM咪唑）、部分金属离子（ ≥ 5 mM Zn2+、≥ 1 mM Cu2+和≥ 10 mM Co2+ ）、异常pH值（如pH值＜6或＞9）等也会影响酶切活性，通畅建议在TEV蛋白酶切割之前就对融合蛋白进行透析等处理。同时发现TEV酶切体系兼容下面蛋白酶抑制剂组分（如aprotinin, benzamidine, leupeptin, pepstatin和PMSF）、以及一些盐组分（如高达2 M NaCl（≤0.2 M NaCl条件下达到最佳活性）、10 mM 浓度的MgSO4/MnCl2/CaCl2）和EDTA(高达100 mM)。

5. 蛋白酶抑制剂Cocktail兼容性？

答：兼容抑制剂Cocktail系列产品，如用于标签蛋白的抑制剂Cocktail（K1010）和通用型抑制剂Cocktail（K1007和K4002）。

6. TEV蛋白酶与哪些反应缓冲液Buffer兼容？

答：推荐酶切反应体系为50 mM Tris-HCl，0.5 mM EDTA，1 mM DTT，pH 7.5。同时，酶在pH值为6-9缓冲液，如HEPES、磷酸钾和乙酸钠缓冲液中也是有活性的。

7. 酶切体系中DTT作用？

答：TEV酶的催化活性完全依赖其活性位点的半胱氨酸残基（Cys151），该残基必须保持还原态的巯基（-SH），才能与组氨酸（His46）形成功能性催化二联体，完成对底物的酶切反应，而DTT作为强还原性二硫苏糖醇，是该体系中维持巯基还原态的核心。TEV蛋白酶反应常需终浓度1 mM的DTT。若消化后需柱纯化而无法使用DTT，省略DTT仍可能实现TEV蛋白酶的成功消化，但仍建议使用DTT，后续透析去除后上柱纯化。

8.酶切切除Tag标签后怎么从反应中去除TEV蛋白酶？

答：TEV蛋白酶在其N端含有His标签肽，在融合蛋白切割后，通过固定金属亲和层析从切割反应中去除TEV蛋白酶。但反应体系中含有EDTA和DTT等成分，在过Ni柱前建议透析除去。

9. 若酶切体系得到的蛋白经SDS-PAGE发现量少该怎么办？

答：建议从融合蛋白加样情况（蛋白量、buffer组成、抑制剂组成）、酶切体系、酶切反应时间（如在4°C过夜或更长时间，有些蛋白可能达三天）等考虑进行优化。

10. 还有哪些用于融合蛋白的标签酶切产品，TEV酶有什么优势？

答：除了Tev酶，还推荐识别Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-▼Gly-Pro系列的PreScission Protease (PSP)（K1101） 和识别SUMO 羧基端(C端) Gly-Gly 后的肽键的SUMO Protease（K1103）。TEV酶对底物序列的识别有更高的特异性，在宽泛的温度范围（4-30°C）和一定的pH范围内（6.0-8.5）有活性，满足多反应条件需求