HyperFusion™ high-fidelity DNA polymerase

1）Q：HyperFusion扩增后的产物是否带A，若后面要做TA克隆该如何操作？

A：使用HyperFusion DNA聚合酶产生的PCR产物具有平末端。如果下一步是克隆，那么推荐使用平端克隆。如果您期望选择T/A克隆，那么DNA应该在A突出加入前纯化（任何剩余的HyPerFusion DNA聚合酶将降解A突出，再次产生平端）。可以用Taq DNA聚合酶或Klenow exo-酶添加无模板的A突出。可以在10 μL反应混合物中用1X Taq缓冲液、2.5 mM MgCl₂、0.2 mM dATP和1 U Taq DNA聚合酶在72°C孵育30分钟。

2）Q：PCR扩增产物条带弥散或者拖尾？

A：可能原因及解决方案如下：

(1) 引物降解：可更换引物排除是否因存储存不当而使引物降解。

(2) 反应程序不够优化：可能退火温度不合适，对退火温度设置梯度，摸索最佳的退火温度。

(3) HyPerFusion DNA聚合酶量过多：一般按0.5-1 U/50 μL反应加入。

(4) 模板降解或过量：可通过电泳检查模板完整性及浓度，必要时重新制备模板。

(5) 琼脂糖凝胶制备不当：待琼脂糖完全融化后再加入制胶槽。

3）Q：PCR扩增产物条带大小与理论不符？

A：可能原因包括：(1) 实验操作不当体系导致污染污染：对工作台进行清洁，使用全新的试剂和耗材重复实验；(2) 模板或引物拿错：更换正确的模板和引物重新实验；(3) 存在基因亚型：可对研究的基因进行序列分析和BLAST研究，确保是否存在基因亚型。

4）Q：空白对照扩增出现条带？

A：可能原因包括： (1) 引物设计不合理：扩增序列与非目的扩增序列有同源性，PCR也可以扩增出非靶序列的序列；(2) 若扩增产物条带大小与目的条带一致，说明有污染，使用全新的试剂和耗材重复实验。

5）Q：PCR扩增特异性差，出现较多非特异性条带？

A：可能原因包括：(1) 引物设计不佳：引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体，可降低引物浓度或重新设计引物；(2) 模板不纯或被污染：需重新制备模板；(3) PCR程序设计不够优化：如果出现比目的条带小的杂带，可通过提高退火温度，降低循环数调整；如果出现比目的条带大的杂带，可缩短延伸时间、降低循环数；(4) HyPerFusion DNA聚合酶加入过多：一般按0.5-1 U/50 μL反应加入。

6）Q：PCR扩增效率低后无扩增条带？

A：可能原因包括： (1) 引物：检查引物是否因存储不当而降解，引物设计是否合理；(2) 模板：长期放置、反复冻融会导致模板断裂、开环或降解，应使用新鲜制备的DNA双链作为模板；模板GC含量过高会导致DNA的双链无法打开；若模板为cDNA，要确认逆转录所用RNA的纯度及完整度；(3) 扩增体系：反应体系配制错误，建议重复实验；(5) 反应程序温度：如果变性温度过高，酶在前几个循环就迅速失活，温度过低则模板变性不彻底；若退火温度不合适，可对退火温度设置梯度，摸索最佳的退火温度；检查延伸时间是否充足；(6) Mg²⁺浓度：Mg²⁺浓度过低可影响PCR产量甚至使PCR扩增失败，Mg²⁺浓度过高会降低PCR的特异性。