1）Q：收到产品后应怎么保存？

A：所有组分-20°C保存，有效期2年。因为5X First-Strand Buffer中含有DTT，故也需-20°C保存。

2）Q：能否通过延长逆转录时间来提高逆转录效率？

A：对于大多数基因，延长逆转录时间对逆转录效率并没有明显的提升；但对于一些GC含量较高或含高级复杂结构的模板，延长逆转录时间可提升逆转录效率

3）Q：原核生物RNA能否用该逆转录酶？

A：可以。因为原核生物的RNA没有poly A尾，在逆转录反应体系中需要选择Random primer作为逆转录引物。

4）Q：逆转录反应引物如何选择？

A：常用引物类型包括：随机引物、Oligo dT和基因特异性引物，选择情况如下：

a. 随机引物：随机结合在RNA的任何区域，适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA类型的逆转录反应。

b. Oligo dT：适用于具有Poly A尾的RNA（原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA是不具有PolyA尾的）。由于Oligo dT结合在PolyA尾上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量的降解也会使全长cDNA合成量大大减少。

c. 基因特异性引物：与模板序列互补，适用于序列已知的基因逆转录。

当cDNA后续是用于qPCR实验时，一般使用Oligo dT和随机引物的混合物，可以避免3’端和5’端的扩增偏好性；当cDNA后续是用于PCR扩增长片段时，一般用Oligo dT或者基因特异性引物，不建议使用随机引物。因为随机引物是随机结合的，cDNA片段会偏短，可能会对长片段扩增造成稀释，后续扩增不出全长的目的基因。

5）Q：可以通过测逆转录产物cDNA的浓度来判定逆转录的效率吗？

A：不可以。因为逆转录产物除了cDNA外，还有buffer、逆转录酶、引物、未转录的模板RNA等，这些都会干扰cDNA浓度测定结果，因此不能反应真实的cDNA产量。

6）Q：逆转录产物用PCR扩增后跑胶检测无特异性条带？

A：可能原因及解决方案如下：

a.引物设计欠佳或逆转录产物质量欠佳：可先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增，看是否可以成功扩增。如果内参不能被很好地扩增，则有可能PCR引物存在问题或逆转录产物质量欠佳。

b.模板RNA发生了降解：哺乳动物细胞或组织的总RNA琼脂糖电泳后应该可以看到清晰的18S和28S rRNA条带，并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例应该大于等于2.0，如果比例小于2.0，则说明总RNA发生了显著的降解，需重新制备模板。

c.模板RNA的纯度偏低：在提取纯化RNA的过程中，残留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA等会抑制逆转录酶活性。可对RNA样品进行柱纯化，或者进行沉淀、洗涤和再溶解，通常可以有效去除残留的污染物。

d.逆转录模板量不足：在抽提获得总RNA后，在进行一些精细的定量检测时通常会进行DNase I消化，以充分去除可能的残留的DNA的干扰。DNase I进行热失活时，需要加入EDTA至终浓度为2.5mM，否则RNA在没有螯合剂的情况下，在加热过程中容易被水解，从而导致模板量不足。此外，扩增特定基因时，需要先查询该基因的组织分布特点，利用其高表达的组织进行目的基因的反转录和克隆。

e.逆转录引物类型选择不当：对于细菌RNA和不含poly A尾的RNA，要用随机引物代替Oligo(dT)引物。使用基因特异性引物时，需要确保基因特异性引物设计合理正确。

f.RNA模板富含GC或容易形成二级结构：可考虑把反转录温度提高到45-55°C。