PreScission Protease (PSP)

1) 对于蛋白表达和纯化，建议引入什么标签？为什么常推荐客户使用His标签？哪些标签有利于提到蛋白可溶性？

A：常用的标签有His, GST, MBP, Trx, TF, MBP, Nus, SUMO, Flag和Fc等。专家会根据蛋白的性质以及客户的特殊要求推荐不同的标签。单独的His标签或者His与其它标签的混合（比如His-GST）是最常用的纯化标签。

His标签较小，一般对下游应用影响不大。且后期纯化成本低。有利于提高蛋白可溶性的标签有: GST, MBP, Trx, TF, MBP, Nus, SUMO等。

2) 在标签和目的蛋白之间，推荐引入什么蛋白酶切位点？

A：如果需要去除标签，建议在标签和目的蛋白之间引入肠激酶，凝血酶，TEV蛋白酶，PSP蛋白酶（PreScission Protease）或SUMO蛋白酶切位点。

3) 建议在蛋白N端还是C端引入标签和蛋白酶切位点？

A：我们建议在蛋白N端引入蛋白酶切位点和标签，而不是在C端引入，因为C端标签经蛋白酶酶切后会残留4-6个氨基酸。

4) 重组蛋白N端标签经什么蛋白酶酶切后不会残留氨基酸？

A：A:重组蛋白N端标签经EK酶和SUMO酶酶切后不会残留任何氨基酸，经TEV酶切后会残留一个甘氨酸 "G"或"S"，经PSP蛋白酶（PreScission Protease）酶切后会残留一个甘氨酸"G"和一个脯氨酸"P"。

5) 为什么不能直接给出酶切放大的费用？

A：我们在酶切放大前建议先进行酶切小试，摸索最佳酶切比例及酶切条件；如果酶切小试效果较好，我们可以根据酶切小试的结果以及您后续需要的tag free蛋白量进行评估报价。如果酶切小试效果不好，不建议进行后续的酶切放大。

6) 为了提高溶解度，最常使用哪些标签？最常使用什么标签进行纯化？

A：通常，我们在使用哺乳动物表达产生重组蛋白时不会遇到不溶性问题。大多数时候，哺乳动物细胞中产生的蛋白质是完全加工的分泌蛋白质，因此没有不溶性问题。对于困难蛋白质诸如膜蛋白，我们通常使用含有去污剂的商业试剂来裂解细胞以用于检测和定量目的。常规使用的标签包括His标签、Fc融合标签和Flag标签。

7) 通常会建议蛋白添加标签表达的原因？

A：有成功表达纯化无标签蛋白的经验，但是，为了提高蛋白的表达、方便后续蛋白的纯化，会在征得客户许可前提下，带标签进行蛋白表达。

8) 对于昆虫系统，常用促溶标签有哪些？常用的纯化标签?

A：促溶标签有GST。常用的纯化标签有His标签。也可以使用Flag、Fc、GST标签。

9) HA标签氨基酸序列是?

A：HA标签序列是"YPYDVPDYA"。

10) 在哺乳动物系统中，常用的标签和蛋白酶切位点有哪些？

A：常用标签有Fc、MON-Fc、His和Flag标签。添加Fc标签以提高表达水平。MON-Fc是改进的Fc，可用于降低Fc融合蛋白的聚集。His和Flag标签是小标签，可以用于亲和纯化。TEV和肠激酶位点是常用的蛋白酶位点。肠溶激酶位点在去除标记物后不会引入氨基酸残留，但其酶特异性不如TEV。