LPS, from Escherichia coli O55:B5

1. 溶解与外观：总是浑浊怎么办？

A：储存液浓度 ≥2 mg/mL。推荐使用硼硅酸（硅烷化）容器，也可使用聚丙烯(PP)塑料容器。可尝试充分涡旋震荡 ≥10 min，必要时辅以超声（温度＜60℃）。
LPS 在水和 PBS 中倾向于形成胶束/胶束状聚集体，在多种溶剂里都容易呈乳白或浑浊悬浮，即使用甲醇等有机溶剂也难做到完全澄清，这是其物理化学性质决定的（不是“没溶解好”）。

有文献表明，一定浓度的 DMSO 可显著抑制 LPS 诱导的炎症反应，细胞实验中建议用无菌水配制储备液，然后用培养基进行稀释。

2. 为什么不同批次看起来“剂量–反应”不稳定？（同样标称浓度，刺激后细胞反应明显变弱或批次间差异大）

A：可能是LPS 有效浓度在衰减。
推荐解决方案：
1）原粉配成 高浓度母液（≥2 mg/mL），分装成小份（一次用完量），-20 ℃ 避光保存；
2）使用时现配工作液，不要反复冻融稀释液；
3）关键实验尽量使用低吸附管，并在加入细胞前再次充分混匀（涡旋）。

关于 LPS 在器皿上吸附以及对有效浓度影响，可参考 endotoxin 处理综述：Sinobiological “Endotoxin in Cell Culture” 对容器吸附问题有专门讨论。
链接：https://www.sinobiological.com/resource/endotoxin-overview/endotoxin-in-cell-culture

3.  细胞对 LPS 不响应或响应变弱怎么办？

3.1 注意事项
LPS 通过 TLR4–MD‑2–CD14 复合体发挥作用，细胞是否表达这些分子、以及血清中是否有可溶性 CD14 / LBP，会强烈影响敏感性。
细胞系、传代次数、血清批次、培养基类型都会显著改变对 LPS 的反应。
3.2 常见问题
1）以前同样条件有明显 TNF‑α/IL‑6 / NO 反应，现在几乎没有；
2）更换 FBS 批次或长期高传代后，发现 LPS 反应性下降。
3.3 解决方案
从以下几方面排查：
1). 细胞状态：保证对数生长期、活率 ≥90%，不过度汇合；
2). 传代数：尽量使用低传代细胞，超过一定传代可重新复苏原冻存管；
3). 血清与培养基：
          保持相同品牌/批次 FBS，必要时做“血清批次预实验”；
          单核/巨噬细胞常推荐用 RPMI 或含适量 FBS（5–10%）的 DMEM；
4). 适当提高 LPS 浓度或延长刺激时间，并同时设置阳性批次 LPS 对照（同一瓶 stock）。

参考：关于 LPS 在细胞培养中敏感性受多因素影响的综述，见 “Various factors affect lipopolysaccharide sensitization in cell cultures” （ResearchGate 收录）。
链接：https://www.researchgate.net/publication/342900234_Various_factors_affect_lipopolysaccharide_sensitization_in_cell_cultures

4.  剂量选择与毒性控制

4.1 注意事项
LPS, from E. coli O55:B5 是经典的高致热原、高毒性 LPS，文献中可引起明显细胞炎症甚至死亡，小鼠中高剂量可致急性死亡。
不同细胞类型和动物品系对 O55:B5 的耐受度差异很大，不能直接照搬别人的剂量。
4.2 常见问题
     参考文献剂量直接使用，结果：
    1）细胞大量凋亡/坏死，无法区分“炎症激活”还是“细胞毒”；
    2）动物实验中死亡率远高于预期，伦理风险高，数据不可用。
4.3 解决方案
体外：
新细胞系首次使用时，先做宽范围剂量梯度（如 1, 10, 100, 1000 ng/mL）+ 24 h/48 h 时间梯度，同时测细胞活率与炎症指标，找出“最大非毒性激活剂量”。
体内：
参考相同物种与品系的文献，同时从略低剂量起步做预实验，观察 24–72 h 生存及体温/行为；
严格遵守动物伦理审批中的最大剂量与 humane endpoint。

动物毒性例：有研究报道 E. coli O55:B5 LPS 在小鼠中的致死性与剂量密切相关，用于急性炎症/败血症模型时需谨慎滴定。

示例：Research Gate 上 “Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5 (LPS) induce mortality of mice”。
链接：https://www.researchgate.net/publication/397187796_Lipopolysaccharides_from_E_coli_O55B5_LPS_induce_mortality_of_mice

5. LPS O55:B5 与 O111:B4的区别：