HyperScribe™ All in One mRNA Synthesis Kit II (EZ Cap Reagent AG (3' OMe), T7, poly(A))
All in One mRNA体外转录试剂盒，EZ Cap Reagent AG (3' OMe)加帽，poly（A）加尾
特色产品
- 适用于流式细胞仪和荧光显微镜检测
- 准确区分活细胞/凋亡细胞/坏死细胞
- 用于免疫印迹和质谱分析等后续操作
- 适用于30 KDa-130 KDa大小的蛋白
- 对细胞无毒性
- 步骤更简单，无需有机溶剂
- 可将信号灵敏度提高100倍
- 同时保持稳定的特异性和分辨率
- 提供更高的转录效率并抑制免疫激活
- 使用5-moUTP和Cy5-utp修饰
- 优异的扩增效率、可重复性和稳定性
- 卓越的灵敏度和准确性，操作简单
- 优化的缓冲液和T7 RNA聚合酶混合物
- 20 μL反应体系可获得更高的RNA产量
产品描述
HyperScribe™ All in One mRNA Synthesis Kit II (EZ Cap Reagent AG (3' OMe), T7, poly(A))试剂盒用于在体外快速合成EZ Cap Reagent AG (3' OMe)加帽和poly（A）加尾的mRNA。通过使用T7 RNA聚合酶，加帽试剂（EZ Cap Reagent AG (3' OMe)，货号B8178）以共转录方式被掺入mRNA 5'端，形成Cap1结构。EZ Cap Reagent AG (3' OMe)的添加保护mRNA免于降解并确保高翻译效率。经过短暂的DNase I处理以去除模板DNA后，加帽的mRNA可以利用Poly（A）聚合酶在3'端进行加尾。聚腺苷酸化（即Poly（A）尾的添加）使mRNA更加稳定并提高mRNA的翻译起始效率。
该试剂盒有诸多应用，例如体外翻译、反义RNA和RNAi实验、RNA疫苗，RNA结构和功能研究，核酶生物化学，RNase蛋白质实验和基于探针的杂交印迹。
每次标准反应为20 μL，该试剂盒可进行25次反应。对于每次的标准反应，1 μg 的对照模板可产生25-180 μg 的RNA。
产品性质
| 产品有效期 | 2年 |
| 运输条件 | 干冰 |
| 注意事项 | 操作过程请严格保证无RNA酶和DNA酶污染。 |
产品组分
| 组分 | 组分货号 | 组分规格 | 保存条件 |
|---|---|---|---|
| EZ Cap Reagent AG (3' OMe) (60 mM) | B8178S1 | 50uL | -20°C |
| ATP Solution (100 mM) | K1043 | 100uL | -20°C |
| ATP (20 mM) | K1043S1 | 50uL | -20°C |
| GTP (20 mM) | K1044S1 | 37.5uL | -20°C |
| CTP (20 mM) | K1045S1 | 50uL | -20°C |
| UTP (20 mM) | K1048S1 | 50uL | -20°C |
| RNase-free H2O | S0223 | 0.5mL | -20°C |
| Nuclease - free Water | S0223 | 2x1mL | -20°C |
| T7 RNA Polymerase Mix | S0248 | 50uL | -20°C |
| 10X Reaction Buffer | S0249 | 50uL | -20°C |
| Control Template(0.5 ug/uL) | S0254 | 5uL | -20°C |
| E-PAP (2 units/uL) | S0255 | 100uL | -20°C |
| 5X E-PAP Buffer | S0256 | 600uL | -20°C |
| 25 mM MnCl2 | S0257 | 250uL | -20°C |
运输条件:干冰 产品有效期:2年 | |||
操作说明
常见问题
1. Q：RNA产物片段大于预期？
A：如果电泳显示产物条带大于预期，可能原因：①质粒模板可能没有完全线性化；②有义链3’端为突出结构；③RNA存在未完全变性的二级结构。建议确认模板结构，并将电泳方式由琼脂糖胶换成变性胶来检测RNA产物。
2. Q：RNA产物片段小于预期。
A：如果电泳显示产物条带小于预期大小，可能原因：①模板序列中包含类似于T7 RNA聚合酶的终止序列；②模板中GC含量高形成高级结构；③RNase污染。不同的聚合酶识别不同的终止序列，若是模板中含终止结构，建议尝试不同的RNA聚合酶。如果模板为高GC，建议加入SSB蛋白，以提高转录效率。出现产物条带与预期不一致，请跑变性胶检测产物。
3. Q：产物电泳拖尾现象。
A：电泳过程中有拖尾现象，可能原因：①实验操作过程被RNA酶污染；②DNA模板被RNase污染。体系中的RNA酶抑制剂只能抑制痕量的RNA酶残留，建议重新纯化模板DNA，并在实验过程中使用RNase-free的枪头和EP管，佩戴一次性乳胶手套和口罩，所有试剂均用RNase-free H2O配制。
4. Q：模板中间有一段Poly T中止序列，后面的序列可以转录出来吗？
A：模板中有发卡结构会影响转录，序列一般不会影响转录。
5. Q：模板一定要是双链吗？
A：至少T7启动子要是双链的。
6. Q：合成的RNA如何纯化？是否有配套的过柱纯化盒子？
A：可使用RNA Clean and Concentrator Kit (K1069)进行RNA纯化，或使用Oligo (dT) 25 Beads (K1306/K1307)纯化带有polyA尾巴的mRNA。
7. Q：使用线性化的质粒时，线性化质粒的方法有哪些？
A：酶切（注意选择酶切位点时不要选择3’端突出的酶切位点）、PCR（得到PCR产物，若模板没有T7启动子和poly A序列，可在PCR的正向和反向引物中分别引入）。
8. Q：使用质粒作为模板时，在线性化的过程中，为什么需要使用平末端或者5’突出末端的限制性内切酶进行线性化？
A：原因和环状质粒为模板相似，都是会因为没有终止子而无限循环下去，从而导致生成的产物片段大小不一。
9. Q：sgRNA条带模糊。
A：sgRNA是100 nt左右的单链RNA，在水溶液中容易形成二级结构，因此电泳时会位置会发生变化，采用加速冷冻或者甲酰胺变性凝胶电泳可以改善电泳结果。
10. Q：体外转录试剂盒适用的片段范围是多少？
A：最小做过100 bp左右的sgRNA，最大做过10 kb (自复制RNA)。
11. Q：针对大片段和小片段，转录的效率如何？
A：大片段会出现条带弥散的情况，因为片段越长酶越容易从模板上脱落，所以得到的产物条带就不是那么集中，其他同类公司的产品也会出现类似的情况。短的模板小于300nt的，较短的转录其实对反应有抑制作用，所以要适当延长反应时间，可以过夜16 h。因为模板和酶进行结合时识别启动子的过程需要时间，所以模板太短时会对反应造成抑制作用，同时建议增加模板量至2 μg。
12. Q：模板中存在高级结构（高GC或是茎环结构），怎么做可以提高产量？
A：提高温度，如果有很多高级结构存在可以建议加入SSB蛋白。
13. Q：模板中存在类似于T7终止序列（也是一种茎环结构）怎么做可以提高产量？
A：降低反应温度。
14. Q：产物纯化方式比较。
A：酚/氯仿抽提的优点是便宜，但是有可能会残留游离的核苷酸。柱提法优点可以将游离的核苷酸去除干净，但价格相对较贵。切胶回收的方法得到的产物更加均一。磁珠法优点是快速且回收效率高，可达到90%以上。
15. Q：转录反应得到的产物量较低可能的原因及建议。
A：(1) 产物长度小于300 nt时，建议提高产物的投入量至2 μg，适当延长反应时间。
(2) 阳性对照，试剂盒中提供的阳性模板大小在1000 bp左右，对于阳性对照的实验设计可以在选择反应2 h后从20 μL的体系中取出5-10 μL确定产量，剩下的体积继续反应至实验组的反应时间相同后确定产量。
(3) 不同的纯化方式产生的损失是不同的。
(4) 可以重新纯化模板。
(5) 确定模板定量以及其完整性。
(6) 尝试其它的启动子和RNA聚合酶。
16. Q：模板投入量增加为2 μg时，NTP的量以及DNA酶的量是否需要调整？
A：模板投入量增加为2 μg时，NTP的量不用调整，若担心模板消化不彻底，可将DNA酶的量从1 μL提高至3 μL。
17. Q：对照组投入0.5 μg产出是多少？
A：Control Template的长度约1000 bp，投入0.5 μg，根据老款和升级款kit不同，产出约50-150 μg范围。
18. Q：T7启动子TATA后面带有三个GGG的作用是什么？
A：GGG的作用是提高转录效率的。
19. Q：体外转录的试剂盒组分中有预混RNase抑制剂吗？
A：试剂盒所用的T7 RNA Polymerase Mix已包含RNase抑制剂以及焦磷酸酶等，内部RNA 酶抑制剂只能抑制少量RNA酶残留，建议实验过程中严格遵守RNase-free操作。
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