HyperScribe™ Poly (A) Tailing Kit

1. 阳性对照反应

1. 用HyperScribeTM T7 High Yield RNA Synthesis Kit试剂盒转录2μL EGFP对照组模板，不要在转录反应中加入放射性标记的UTP示踪剂。

2. 按照T7 RNA合成试剂盒的中的方法，用DNase I处理转录本。

3. 根据第3部分的方法给转录本加poly(A)尾，但额外加入[α-32P] ATP（任何特异性都可以用）；通过跟踪放射性标签，可以更容易地检测出在终反应中有多少ATP结合到poly(A)尾中；记得在向反应混合液加入E-PAP之前吸取留样，作为无酶反应体系（阴性对照）。

4. 通过TCA沉淀法检测结合的带标记的RNA。（成功的加尾反应结合至少50%的放射性标签）

5. 取0.5μl的阳性对照反应液及相应的无酶反应液进行电泳（用2.5%的甲醛-琼脂糖凝胶），同时用RNA markers。

（加poly(A)尾的产物其电泳条带应该比无酶反应产物的条带大至少150碱基）

2. 凝胶中无RNA可见

1. 转录反应的问题

参考T7 RNA合成试剂盒（HyperScribeTM T7 High Yield RNA Synthesis Kit）方法的注意事项。

2. RNase污染

用RNaseZap® Solution处理所有设备及凝胶盒等，并用RNase-free的管子和试剂。

3. 加尾反应后的产物RNA与未加尾的没有可见的大小区别（在凝胶中）

1. 通过阳性对照反应检查试剂盒的组分

验证阳性对照反应结合了至少50%的放射性标记的ATP。

2.如果阳性对照没问题，但实验组的转录本出现问题

凝胶分辨率不足

如果实验组转录本有几Kb大小，琼脂糖凝胶的分辨率可能不足以分辨尺寸的变化。用标签示踪法检测反应（见下部分）

标签示踪法

如果阳性对照反应的产物比无酶反应产物更大，但实验组不是这样，那么就在加尾反应体系中加入示踪标记，通过TCA沉淀法测量结合的标记。

如果结合的标记少于50%， 但放射性标签的掺入大于背景，增加酶的用量或ATP的浓度可能实现理想长度poly (A)加尾的生成。