PolQi1

PolQi1（CAS 2607139-80-8）是一种针对 DNA 聚合酶 θ（Polθ）聚合酶结构域的选择性小分子抑制剂，核心功能为阻断替代性末端连接（alt-EJ/TMEJ）通路，广泛用于优化 CRISPR/Cas9 及 Prime Editing（PEn）介导的基因组编辑，减少不精准修复并提升靶向整合效率。

当 PolQi1 浓度为 1-3μM 时，在 HEK293T、Jurkat 等细胞中可部分降低 CRISPR/Cas9 诱导 DNA 双链断裂（DSB）后的微同源性介导缺失（MH-del，≥2bp）频率，减少大缺失等不精准修复事件，且不会导致细胞汇合度降低或增殖抑制；在 HEK293T 细胞中，其对 alt-EJ 的抑制效果接近 Polθ 基因敲除（POLQ-KO），但单独使用时对同源定向修复（HDR）效率的提升有限。

将 1μM DNA-PK 抑制剂 AZD7648 与 1-3μM PolQi1 联合使用（即 “2iHDR” 或 “2iPEn” 策略）时，可显著优化基因组编辑性能：在 HEK293T 细胞中可使 HDR 介导的单链 DNA（ssDNA）整合效率最高提升 4.9 倍，Jurkat 细胞中提升 5.2 倍，人诱导多能干细胞（hiPSC）中提升 3.6 倍，原代人 CD4+T 细胞中提升 12.6 倍；在 HEK293T 细胞中，该联合方案可使非同源末端连接（NHEJ）介导的小插入缺失（InDels，±1bp）及 alt-EJ 介导的 MH-del 总频率降低 17.4 倍，hiPSC 中降低 2.3 倍；无供体模板时，可显著提升未修饰等位基因比例，减少非特异性编辑。

在 nuclease-based Prime Editing（PEn）系统中，1μM AZD7648 与 3μM PolQi1 联合使用可使 HEK293T 细胞编辑精度提升 4.3 倍，HeLa 细胞提升 9.8 倍，减少包含 pegRNA 支架序列的不精准 prime edits，同时维持 PEn 对 nickase-based PE resistant 位点的高编辑活性；针对 HEK3、HEK4 等已知脱靶位点（共 13 个），该联合方案可使脱靶编辑频率平均降低 74%；在 HEK293T 细胞双位点编辑（HBEGF+PCSK9）中，可显著降低平衡易位频率，而单独使用 AZD7648 或 PolQi1 时易位抑制效果有限。

此外，1μM AZD7648 与 3μM PolQi1 的联合方案可兼容短片段（39bp HiBiT 标签）及长片段（975bp HaloTag-HiBiT 融合标签）供体模板，在 Jurkat 细胞中对 975bp 片段的整合效率最高提升 31 倍，编辑结果稳定，2 周后仍可检测到整合；对 Jurkat 细胞单克隆筛选显示，80% 以上阳性克隆为该片段的同源整合，且细胞增殖能力不受影响。

参考文献：

[1] Wimberger S, Akrap N, Firth M, Brengdahl J, Engberg S, Schwinn MK, Slater MR, Lundin A, Hsieh PP, Li S, Cerboni S, Sumner J, Bestas B, Schiffthaler B, Magnusson B, Di Castro S, Iyer P, Bohlooly-Y M, Machleidt T, Rees S, Engkvist O, Norris T, Cadogan EB, Forment JV, Šviković S, Akcakaya P, Taheri-Ghahfarokhi A, Maresca M. Simultaneous inhibition of DNA-PK and Polϴ improves integration efficiency and precision of genome editing. Nat Commun. 2023 Aug 14;14(1):4761. doi: 10.1038/s41467-023-40344-4. PMID: 37580318; PMCID: PMC10425386.

[2] Antoniou Panagiotis, et al. Improved nuclease-based prime editing by DNA repair modulation and pegRNA engineering. BioRxiv (2024): 2024-02.