疫苗组分在体内的去向与释放时机直接决定免疫应答的强度与质量。现有载体大多只把抗原递送至淋巴结供抗原提呈细胞（APC）摄取，忽略了最后一步：把抗原送进内质网（ER）。内质网是MHC I类分子装配与表位装载的场所，抗原进入内质网可以避开溶酶体降解，提高交叉提呈效率，从而增强CD8⁺ T细胞应答。近年纳米载体设计的关注点从尺寸、组分转向表面形貌。有研究报道表面带纳米级尖刺的二氧化钛微球能激活炎症小体、具备佐剂潜力。但研究人员尚未系统阐明尖刺形态促进疫苗递送的原理。近日，来自四川大学的研究团队据此合成带有不同长度尖刺的三种介孔二氧化硅纳米颗粒，验证了不同长度纳米尖刺经淋巴结—APC—内质网的三级递送路径，以及尖刺长度对递送效果与免疫激活的影响及其机制。

为了制备只有表面尖刺长短不同、其余性质一致的纳米颗粒，研究人员用两相界面法合成MN（无刺）、SNS（短尖刺）、SNL（长尖刺）三种介孔二氧化硅纳米颗粒，以 CTAB 作模板剂、调节其用量与反应时间控制尖刺长度；再通过透射电镜与扫描电镜观察形貌，通过动态光散射与氮气吸附-脱附测定粒径和孔径，并用包封率实验、释放实验与低温储存实验检查载药与稳定性。结果显示三种颗粒粒径均匀、孔径一致，抗原肽包封率都超过九成，载药后能持续释放，低温存放后粒径与表面电位基本不变，且在安全浓度范围内对 DC 和成纤维细胞无明显毒性。

综上所述，三种颗粒除尖刺长度外其余性质一致，因此后续实验仅关注尖刺长度。

为了弄清尖刺长度对 DC 成熟的影响，研究人员用三种颗粒处理小鼠骨髓来源的树突状细胞（BMDC），通过流式细胞术检测CD40、CD86等成熟标志，通过ELISA检测 IL-1β、TNF-α、IL-6分泌。结果显示，尖刺越长、DC成熟越充分。SNL组的成熟标志表达与三种炎症因子分泌都显著高于 MN 组。

为了检查尖刺是否促进 DC 摄取抗原，研究人员把荧光标记的OVA抗原肽（OP）包封进三种颗粒处理细胞，通过流式细胞术与共聚焦显微镜检测摄取效率，并在DC、巨噬细胞、成纤维细胞三种细胞中比较选择性。结果显示OP摄取效率随尖刺变长而增加，且这种增强主要发生在DC，巨噬细胞和成纤维细胞几乎不受影响。

为了排除颗粒大小不同的干扰，研究人员另合成小粒径无刺颗粒和与SNL同样粒径偏大的无刺颗粒，通过同样的摄取与成熟实验比较三者。结果显示大小接近的无刺颗粒之间差异不大、且都不如SNL，说明起作用的是尖刺形态而不是粒径。

为了检查尖刺颗粒能否提高抗原交叉提呈，研究人员用载有OP的颗粒处理BMDC，通过流式细胞术检测MHC I–SIINFEKL复合物水平，并把处理过的BMDC与IL-2启动子带有LacZ的报告T细胞B3Z共培养、检测T细胞激活。结果显示SNL组交叉提呈和T细胞激活都最强，体内淋巴结实验也证实了这一优势。

综上所述，尖刺越长越能促进DC成熟、抗原摄取与交叉提呈。SNL无需外加佐剂即可同时激活DC并提升抗原交叉提呈效率。

为了找出SNL激活DC的分子机制，研究人员分别用PBS、MN、SNL处理BMDC，通过转录组测序鉴定差异基因，并用富集分析归类。结果显示SNL上调的基因集中在细胞运动、迁移与免疫应答，还包括几个机械感觉相关基因，提示SNL通过更强的机械刺激发挥作用。

为了验证机械刺激假说，研究人员通过纳米压痕仪测定细胞硬度，通过钙荧光探针Fluo-4结合流式细胞术检测钙内流，并同时重点关注机械敏感离子通道Piezo1，用Piezo1抑制剂GsMTx4、激动剂Yoda1和胞膜窖破坏剂nystatin做对照干预，用钙调磷酸酶抑制剂CsA阻断NFAT通路，通过qPCR检测相关基因表达并评估DC激活程度。结果显示，SNL处理后细胞变硬、钙内流明显增强。GsMTx4能显著抑制这种内流，且GsMTx4和CsA阻断都削弱SNL的基因上调和DC成熟。

综上所述，SNL通过细胞膜机械刺激激活Piezo1，沿Piezo1—钙内流—NFAT通路激活DC。

为了追踪 SNL 进入细胞后的去向和抗原释放位点，研究人员用ER-Tracker Red和Lyso-Tracker Red两种荧光探针分别标记内质网与溶酶体，通过共聚焦显微镜观察颗粒与它们的共定位，并用钙螯合剂BAPTA-AM检验钙信号是否必需，又在每个颗粒中包封分别用FITC与TRITC两种荧光标记的OP，利用两荧光基团分离会出现FRET效应特性，以信号减弱判断抗原与载体分离。结果显示SNL摄取后很快与内质网明显共定位，BAPTA-AM显著削弱这种定位，无刺的MN则主要蓄积在溶酶体。SNL与内质网共定位后， TRITC信号随时间减弱、FITC信号恢复。

为了确定两种颗粒各自依赖哪条提呈通路，研究人员用TAP抑制剂probenecid、ERAP1抑制剂ERAP1-IN-1和转运抑制剂BFA分别处理BMDC，通过报告T细胞测定相对交叉提呈率。结果显示，probenecid使MN的提呈明显下降、对SN却无影响。ERAP1-IN-1使SNL的提呈效率下降约六成。BFA 则同时抑制两种颗粒。

综上所述，尖刺改变了颗粒在细胞内的路径。SNL避开溶酶体、优先进入内质网并就地释放抗原。而MN 把抗原释入胞质，其提呈依赖TAP把肽段转运进内质网。

为了检查SNL能否同样把STING激动剂送进内质网，研究人员把内源性STING激动剂cGAMP（B8362）与OP包封进颗粒处理DC，通过分离内质网与溶酶体组分、ELISA定量cGAMP分布，再通过 ELISA、蛋白质印迹与qPCR检测IFN-β分泌、TBK1/IRF磷酸化与干扰素基因表达。结果显示 SNL 组内质网里的cGAMP明显多于MN，下游干扰素信号也随之更强。

为了确认cGAMP与SNL的协同作用，研究人员通过交叉提呈实验、DC成熟标志检测和体内淋巴结实验比较不同颗粒的效果。结果显示SNL装载的抗OP与cGAMP（OP/cGAMP@SNL）可同时增强交叉提呈、DC成熟与淋巴结免疫激活，各项指标都高于MN。

综上所述，SNL把STING激动剂递送至其作用位点内质网，增强了cGAMP激活的下游信号。

为了评估SNL体内免疫激活能力，研究人员以OP为模型抗原，用不同纳米颗粒和佐剂制成疫苗，对小鼠进行不同方案的皮下注射，通过ELISA 检测血清抗原特异性抗体（IgG、IgG1、IgG2a），通过流式细胞术检测淋巴结B细胞活化与记忆B细胞。结果显示，OP/cGAMP@SNL组抗体水平最高，IgG2a水平远超MN组，B细胞活化与记忆分化也更强。

为了评估T细胞应答，研究人员取免疫小鼠的淋巴结细胞与脾细胞，在体外加入OP进行刺激，通过流式细胞术检测CD4+/CD8+T细胞活化与胞内因子，通过ELISpot检测IL-2与IFN-γ分泌，并用CFSE标记靶细胞回输，检测CTL体内杀伤。结果显示SNL组T细胞活化最强、偏向Th1型，IL-2与IFN-γ分泌和CTL杀伤都明显高于其他组，且多次免疫未引起血液学或脏器毒性。

综上所述，基于SNL的疫苗能在体内同时强化体液免疫与细胞免疫。

为了检查免疫应答能否持久，研究人员使用之前制备的疫苗，给小鼠皮下注射三次，在首次免疫后第160天处死小鼠，通过流式细胞术检测脾脏生发中心B细胞活化、记忆B细胞、T细胞活化与记忆T细胞，并取淋巴细胞加入OP再刺激检验T细胞应答。结果显示OP/cGAMP@SNL组活化B细胞与记忆B细胞比OP/cGAMP@MN组显著升高高，CD4⁺与CD8⁺ T细胞经OP再刺激后仍被激活。

为了解释这种长效优势，研究人员把FAM标记的OP抗原包封进Cy5荧光标记的MN与SNL，皮下注射给小鼠，在不同时间点取淋巴结，通过流式细胞术测定颗粒在淋巴结内及DC内的蓄积，通过冰冻切片与共聚焦显微镜观察OP抗原与颗粒的共定位，并在注射12小时后鉴定淋巴结内摄取颗粒的细胞类型。结果显示SNL在淋巴结与DC内的蓄积高于MN。OP抗原与SNL在淋巴结内明显共定位。摄取SNL的细胞中cDC2亚群最多。这类细胞负责诱导滤泡辅助性T细胞、支持B细胞记忆分化。

综上所述，SNL凭借更高的淋巴结递送效率与cDC2摄取，维持更久的免疫记忆。

为了检查抗肿瘤效力，研究人员做了预防实验（在首次注射疫苗后第35天给皮下接种EG7-OVA淋巴瘤细胞）和治疗实验（先接种EG7-OVA细胞再通过皮下注射疫苗进行治疗），测量各组肿瘤体积与生存期，在治疗后取肿瘤与肿瘤引流淋巴结，通过流式细胞术检测DC成熟、T细胞活化与Treg比例，通过HE染色观察肿瘤坏死与淋巴细胞浸润，并通过ELISA检测肿瘤局部细胞因子。结果显示各纳米疫苗组都延缓肿瘤生长，含有cGAMP的疫苗优于不含cGAMP的疫苗、SNL优于MN，OP/cGAMP@SNL效果最好。治疗实验中 OP/cGAMP@SNL也显著延缓肿瘤并延长生存。SNL组淋巴结DC成熟与T细胞活化最强、Treg减少，肿瘤内CD8⁺ T细胞与M1巨噬细胞增多、M2巨噬细胞与Treg减少，坏死与淋巴细胞浸润更明显，TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IFN-β等促炎因子水平更高。

综上所述，OP/cGAMP@SNL在EG7-OVA模型中可逆转肿瘤免疫抑制、增强抗肿瘤免疫应答。

为了在宫颈癌场景检验这一平台，研究人员把含MHC I/II表位的HPV16 E7肽（HP）与cGAMP包封进SNL注射给小鼠，通过ELISA检测抗体，通过流式细胞术检测B细胞、滤泡辅助性T细胞（Tfh）与记忆细胞的活化，通过ELISpot与CFSE靶细胞杀伤实验检测T细胞功能。结果显示，HP/cGAMP@SNL组抗体滴度更高、B细胞与Tfh活化更强，CD4⁺与CD8⁺ T细胞分泌的IL-2、TNF-α、IFN-γ都明显高于对照组，效应记忆T细胞更多、CTL杀伤更强。

综上所述，HP/cGAMP@SNL处理后T细胞与B细胞应答均强于对照，可作为宫颈癌疫苗的递送载体。

为了检验预防与治疗效果，研究人员分别建立TC-1宫颈癌预防模型（注射疫苗后接种肿瘤）与治疗模型（接种肿瘤后注射疫苗），通过监测肿瘤体积与生存期评价各组的效力。结果显示预防模型中仅包含HP的SNL就能完全阻止肿瘤发生，优于MN。治疗模型中HP/cGAMP@SNL抑制肿瘤最有效，并明显延长生存期。

综上所述，HP/cGAMP@SNL尖刺纳米疫苗在宫颈癌模型中既能预防、也能延缓肿瘤进展。

为了筛选保守抗原，研究人员用NetMHC从SARS-CoV-2野生型与主流变异株的S蛋白中预测高亲和力T细胞表位，用ELISA筛出结合力好的B细胞表位，串联成可被T细胞和B细胞识别的SARS-CoV-2双表位抗原（SP），与cGAMP一起包封进SNL（SP/cGAMP@SNL）注射给小鼠，通过流式细胞术检测B细胞应答、T细胞活化、胞内因子与记忆细胞。结果显示，SP/cGAMP@SNL组活化B细胞、Tfh与记忆B细胞显著增多，CD4⁺与CD8⁺ T细胞的细胞因子分泌超过灭活疫苗数倍，效应记忆T细胞也更多。

为了检验交叉保护，研究人员分离免疫小鼠的淋巴结细胞，分别用SARS-CoV-2野生型、Beta、Omicron变异株的S蛋白再刺激，通过流式细胞术检测CD4⁺/CD8⁺ T细胞活化。结果显示未刺激时各组无差异；野生型刺激下SNL组活化最强，换成变异株抗原刺激后仍能有效活化，且活化水平高于灭活疫苗组。

综上所述， SP/cGAMP@SNL 能诱导强效的T细胞与B细胞双重应答，其中T细胞应答可覆盖 SARS-CoV-2不同变异株，增强了交叉保护效率。

本研究发现长尖刺纳米颗粒（SNL）通过机械刺激激活树突状细胞（DC）表面的Piezo1通道、引发钙内流，既促进DC成熟，又把抗原引向内质网这一交叉提呈关键位点。 SNL无需任何靶向配体即可完成淋巴结、APC、内质网三级递送。使用SNL包封各种抗原肽与STING激动剂cGAMP，可在体内产生协同免疫激活，激发强效、持久的CD8⁺ T细胞应答，延缓或阻断淋巴瘤与宫颈癌肿瘤进展，对SARS-CoV-2感染形成交叉保护。

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