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细胞死亡实验（第二弹）：Elesclomol诱导铜死亡

2026-07-31 13:44:02

伊利司莫（Elesclomol，A4386）是经典的铜离子载体与铜死亡诱导剂。2000年代初，Shionogi BioResearch公司通过高通量筛选发现了抗肿瘤小分子Elesclomol，并尝试将其与紫杉醇联用治疗黑色素瘤，但当时并未研究清楚它的具体机制。直到2015年，Hasinoff团队才证实伊利司莫能在细胞外螯合二价铜离子（Cu²⁺）并将其转运至线粒体，进而诱发细胞死亡。由于该过程伴随活性氧（ROS）的产生，早期研究普遍将其视为一种通过氧化应激触发线粒体依赖性凋亡的药物。2022年，Tsvetkov团队对Elesclomol的作用机制展开深入解析，发现了一种全新的细胞死亡形式。这种死亡由铜离子直接驱动，通过破坏线粒体三羧酸循环中的脂酰化蛋白导致细胞死亡。研究团队将这一现象正式命名为铜死亡（cuproptosis，点击查看），相关成果发表于《Science》。

如今，基于Elesclomol的铜死亡诱导方案已在全球实验室广泛使用。这个模型既能用于解析各类铜死亡相关分子机制，也是铜死亡靶向药物筛选的标准阳性对照。接下来，我们就讲一下具体如何在细胞实验与动物实验中用Elesclomol诱导铜死亡。

实验原理

Elesclomol是脂溶性铜离子载体，可与Cu²⁺形成稳定的中性脂溶性复合物。该中性复合物可依靠被动自由扩散穿透细胞膜，进入线粒体。线粒体基质内的FDX1可将复合物中的Cu²⁺还原为Cu⁺。过量Cu⁺直接结合线粒体脂酰化修饰的DLAT、DLAT蛋白，造成蛋白不可逆聚沉，同时引发FDX1、SDHB、LIAS等线粒体铁硫簇蛋白降解，彻底破坏三羧酸循环功能，启动铜死亡。ES释放铜离子后可再次回到胞外捕获游离铜持续转运铜离子。

Elesclomol的作用机制

（DOI: 10.1016/j.bcp.2014.12.008）

注意事项

①

储存液需分装，-80℃避光保存，避免反复冻融。

②

工作液需现配现用。

③

本实验常见Elesclomol与CuCl₂预混给药和分别给药2种方式，具体给药方式需要根据实验目的进行选择。

►

若研究载体与铜结合的能力，建议采用分别给药。

►

若比较Elesclomol与其他已合成的含铜药物的药效，建议采用预混给药。

④

实验稀释时保证细胞实验体系中DMSO终浓度≤0.1%，动物实验体系中DMSO终浓度≤5%，减少溶剂毒性。

⑤

本实验动物实验以小鼠肿瘤治疗实验为例，其它物种和模型需自行优化实验条件。

⑥

3D细胞培养需要使用专用培养基和培养板。

⑦

1.1 本实验建议设置以下对照：

空白对照：仅DMSO。

CuCl₂阴性对照：仅1 μM CuCl₂。

Elesclomol阴性对照：仅Elesclomol。

逆转对照：用于抑制铜死亡，可以选择TTM（C9054）或其他铜螯合剂。注意：TTM对光敏感，需要避光保存，避免接触强酸、强氧化剂。

排除对照（可选）：用于确认激活的细胞死亡类型为铜死亡，如抗氧化剂NAC（N-Acetylcysteine，A8356）可排除ROS引起的细胞毒性，铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（A4371）可排除铁死亡。Caspase抑制剂Z-VAD-FMK（A1902）可排除凋亡。RIPK1抑制剂Necrostatin-1（A4213）可排除坏死性凋亡。

试剂和耗材

试剂

试剂	描述
Elesclomol	铜离子载体
氯化铜（CuCl₂）	提供铜离子
TTM（四硫代钼酸铵）	铜螯合剂
DMSO	用于Elesclomol母液配制
无菌生理盐水	用于腹腔注射
PBS	用于工作液配制
葡萄糖酸铜	用于灌胃给药
培养基	用于细胞培养
FBS	用于细胞培养
Pen-Strep	用于细胞培养
超纯水	用于溶解无机化合物
Z-VAD-FMK	用于排除凋亡
Necrostatin-1	用于排除坏死性凋亡
Ferrostatin-1	用于排除铁死亡
N-Acetylcysteine（NAC）	用于排除ROS引起的细胞毒性
小鼠饲料	用于动物实验

耗材与仪器

细胞实验	动物实验
培养瓶	灌胃针
96/384孔培养板	注射器
超低吸附培养板（仅3D细胞培养）	记号笔或耳标
6孔板	眼科剪
离心管	眼科镊（用于剥离肿瘤组织）
一次性滤器	用于存放剥离的肿瘤组织
CO₂培养箱	-

溶液准备

溶液	配制方法
Elesclomol储存液	用DMSO充分溶解，浓度10 mM。
CuCl₂储存液	10 mM，用无内毒素超纯水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌。
ES-Cu工作液（可选）	用于细胞实验预混给药。按1:1摩尔比将Elesclomol与CuCl2在PBS中混匀，室温避光孵育5-10分钟形成稳定复合物，再用培养基稀释至所需浓度。
ES-Cu注射液（可选）	用于动物实验预混给药，Elesclomol浓度5 mM，CuCl2浓度0.1 mM
Elesclomol注射液（可选）	用于动物实验分别给药，浓度5 mM。
葡萄糖酸铜工作液（可选）	用于动物实验分别给药，浓度0.5 mg/mL。
TTM储存液	10 mM，超纯水溶解，过滤除菌。

注意事项：

培养基和血清中的成分可能会与铜离子发生结合，因此需要使用PBS（细胞实验）或生理盐水（动物实验）预混Elesclomol与CuCl₂，不能使用含血清培养基。
不同细胞系对Elesclomol敏感性差异大，推荐以20-200 nM的浓度范围进行预实验。对于预混给药，正式实验使用的ES-Cu工作液的浓度需要根据预实验结果确定。
Elesclomol浓度过大可能导致大量ROS产生，引发氧化应激导致的细胞死亡。

实验步骤

步骤		细胞样本	3D细胞/类器官	动物实验
1		取对数生长期的细胞，消化计数后按合适密度接种于培养板中。	取对数生长期的细胞，接种于超低吸附培养板中。	实验前1天对所有小鼠编号、称重、测量相关指标。
		阳性逆转对照加入20 μM TTM。	以24孔板为例，接种密度为2000细胞/孔。
		不同用途的排除对照（可选）分别加入20μM Necrostatin-1，10μM Ferrostatin-1，1mM，5mM N-Acetylcysteine。	-
2		培养过夜至细胞汇合度达60%-70%。	静置培养3天，至形成致密的初代肿瘤球。	给药前正常饮水进食，适应性喂养3天，全程在SPF级动物房超净台内操作。
3	分别给药	去除原培养基，更换为含1 μM CuCl₂的新鲜培养基，孵育30分钟。	去除原培养基，更换为含1 μM CuCl₂的新鲜培养基，孵育30分钟。	使用葡萄糖酸铜工作液进行灌胃给药，50 μg/只。每3天1次，共10次。
	分别给药	加入所需浓度的Elesclomol。	加入所需浓度的Elesclomol。	灌胃后使用Elesclomol注射液进行腹腔注射，Elesclomol剂量为10 mg/kg。每3天1次，共10次。
	预混给药	去除原培养基，更换为ES-Cu工作液	去除原培养基，更换为ES-Cu工作液	使用ES-Cu注射液进行腹腔注射，Elesclomol剂量为10 mg/kg；CuCl₂剂量为0.06 mg/kg。
	预混给药	去除原培养基，更换为ES-Cu工作液	去除原培养基，更换为ES-Cu工作液	每日固定时间给药1次，连续给药5天，停药休息2天为1个周期，共执行2个周期。
4		放入培养箱，孵育2小时。	将培养板放回培养箱继续培养4天，期间无需换液。	给药结束后继续饲养1-2天。
5		吸弃含药培养基，用预热的PBS轻柔洗涤细胞1-2次，完全更换为无药新鲜培养基，继续放回培养箱培养8-24 h后进行结果验证。	进行结果验证。	处死小鼠取样，进行结果验证。

注意事项：

步骤5.3可以选择分别给药或预混给药。
不同细胞系对对照组各类抑制剂敏感性有差异，对于初次建立的实验体系，建议同时选取2-3个浓度，方便优化实验条件。
铜死亡诱导结束后，建议24小时内进行细胞实验结果检测，超过24小时，细胞可能完全死亡降解、无法检测。对于初次建立的实验体系，建议在2-24小时内取多个时间点检测，确定最佳检测时间。

结果验证

铜死亡诱导结束后，可以通过形态学观察、细胞活力检测、ROS检测和分子标志物检测等方法，确认铜死亡诱导是否成功。

●

形态学观察：细胞核完整，有轻度炎症反应，线粒体受损，细胞膜形态基本完好（点击查看）。

●

细胞活力检测：铜死亡是细胞程序性死亡。采用CCK-8或CellTiter-Glo检测细胞活力，可以定量评估ES-Cu诱导铜死亡的效果。

●

ROS检测：铜死亡过程中线粒体大量蓄积游离铜离子，导致活性氧（ROS）的产生，所以ROS是铜死亡伴随的次级损伤信号。使用HPF荧光探针（点击查看）检测细胞内活性氧水平，可以直观检测铜离子在线粒体的异常累积。

●

分子标志物WB/免疫荧光检测：铜死亡会特异性造成线粒体脂酰化蛋白异常寡聚、铁硫簇蛋白降解、铜死亡上游调控分子表达改变，通过WB或免疫荧光检测下列标志物，可判定细胞发生铜死亡：

DLAT：铜死亡发生后大量聚集，WB可见高分子量聚集条带，IF可见胞内蛋白聚集点状荧光；
DLST、FDX1、LIAS、SDHB、ACO2、Fe-S：铜死亡发生后蛋白水平显著降低。

若铜死亡诱导成功，以上现象应只在实验组和排除对照中出现，不应在空白对照、阴性对照、TTM预处理逆转对照中出现。

常见问题

细胞活力下降不明显（诱导失败）

可能原因：细胞系选择不当。铜死亡高度依赖线粒体呼吸，有其他代偿通路的细胞对铜死亡不敏感。

解决方案：优先选择依赖线粒体呼吸的细胞系，或使用含半乳糖（Galactose）的培养基替代葡萄糖，迫使细胞依赖线粒体呼吸，以提高对Elesclomol-Cu的敏感性。

细胞出现典型的凋亡或铁死亡特征

可能原因：药物浓度过高、处理时间过长，或存在其他氧化应激诱导因素，导致细胞发生了非特异性的凋亡或铁死亡。

解决方案：减小Elesclomol和Cu²⁺的浓度或孵育时间。

TTM逆转对照未生效

可能原因：TTM的浓度不足，加入时机过早或过晚。

解决方案：调整TTM预处理时间和工作浓度（常用1-10 μM）。

形态学和活率符合预期，但没有检测到ROS或分子标志物

可能原因：细胞活率过低，靶标降解。

解决方案：减少铜死亡诱导后等待的时间，建议在2-24小时内取多个时间点检测，确定最佳检测时间。

参考文献：

Tsvetkov P, Coy S, Petrova B, Dreishpoon M, Verma A, Abdusamad M, Rossen J, Joesch-Cohen L, Humeidi R, Spangler RD, Eaton JK, Frenkel E, Kocak M, Corsello SM, Lutsenko S, Kanarek N, Santagata S, Golub TR. Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins. Science. 2022 Mar 18;375(6586):1254-1261. doi: 10.1126/science.abf0529. Epub 2022 Mar 17. Erratum in: Science. 2022 Apr 22;376(6591):eabq4855. doi: 10.1126/science.abq4855. PMID: 35298263; PMCID: PMC9273333.
Yu Q, Jiang K, Ma S, Zheng Q, Tondi S, Reina C, Šabanović B, Wen C, Shen B, Aicher A, Song H, Ma Y, Heeschen C. Elesclomol-copper combination synergistically targets mitochondrial metabolism in cancer stem cells to overcome chemoresistance in PDAC. Mol Ther. 2025 Dec 3;33(12):6160-6177. doi: 10.1016/j.ymthe.2025.09.004. Epub 2025 Sep 10. PMID: 40931516; PMCID: PMC12703165.
Liu X, Qu H, Li J, Sun X, Wang Z, Wang D, Bai X and Li X (2025) p53 enhances elesclomol-Cu-induced cuproptosis in hepatocellular carcinoma via FDXR-mediated FDX1 upregulation. Front. Oncol. 15:1584811. doi: 10.3389/fonc.2025.1584811
Hasinoff BB, Wu X, Yadav AA, Patel D, Zhang H, Wang DS, Chen ZS, Yalowich JC. Cellular mechanisms of the cytotoxicity of the anticancer drug elesclomol and its complex with Cu(II). Biochem Pharmacol. 2015 Feb 1;93(3):266-76. doi: 10.1016/j.bcp.2014.12.008. Epub 2014 Dec 27. PMID: 25550273.

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货号	名称	产品描述
A4386	伊利司莫（Elesclomol）	铜离子载体，铜死亡诱导剂
C9054 ^NEW	四硫钼酸铵（TTM）	铜离子螯合剂，铜死亡抑制剂
A1902	Z-VAD-FMK	Caspase抑制剂，用于排除凋亡。
A4213	Necrostatin-1	RIPK1抑制剂，用于排除坏死性凋亡。
A4371	Ferrostatin-1	铁死亡抑制剂，用于排除铁死亡。
A8356	N-Acetylcysteine（NAC）	抗氧化剂，用于排除ROS引起的细胞毒性。

APExBIO未独立实验确认以上方法的准确性，仅供参考。

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