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细胞染色实战（第一弹）：胆固醇可视化——Filipin III 染色指南

2026-05-28 10:26:12

菲律宾菌素 III（Filipin III）是特异性检测游离胆固醇的荧光探针，也是代谢疾病、神经炎症、肿瘤免疫等领域的热门工具。今天我们整理了Filipin III染色避坑指南，结合3篇客户高分文献的实战参数，涵盖不同样本类型，从试剂配制到结果检测，把Filipin III染色的雷区和条件设置一次性讲透。

实验原理

Filipin III是一种从菲律宾链霉菌（Streptomyces filipinensis）分离的多烯大环内酯类抗生素，是一种用于检测细胞膜中胆固醇的探针。它能与游离胆固醇特异性结合，形成蓝色荧光复合物。复合物的激发波长为340-380 nm，发射波长为430-480 nm。通过荧光显微镜或流式细胞仪可观察到胆固醇在细胞膜上的分布情况。

注意事项

①

Filipin III对光和空气高度敏感，所有操作必须严格避光。

②

Filipin III可以溶于无水乙醇或DMSO，配制成1 mg/mL储存液，保存于-20℃。储存液需分装保存，避免反复冻融导致降解，保存时间为3-5天。

③

工作液现配现用，若需保存，应在4℃避光条件下保存不超过24小时。

④

固定剂必须使用4%多聚甲醛（PBS配制，pH 7.4），禁止使用甲醇、乙醇等醇类固定剂，避免使用透化剂（如Triton X-100），因为醇类和表面活性剂会溶解胆固醇。

⑤

如果使用显微镜直接观察培养皿中的细胞，需要使用荧光显微镜或共聚焦显微镜专用培养皿，或制作细胞爬片。

⑥

显微镜观察时，注意避免长时间光照，以减少光漂白

⑦

每次实验建议设置以下对照：

►

空白对照：不加入Filipin III的工作液处理的细胞

►

阴性对照：使用胆固醇耗竭剂处理的细胞

试剂与器材

主要试剂

试剂名称	存储条件
Filipin III粉末	-20℃避光分装保存。
4%多聚甲醛(PFA)固定液	4℃保存，2周内使用。
PBS缓冲液	4℃避光保存。
抗淬灭封片剂	4℃避光保存。

实验器材

►

荧光显微镜或共聚焦显微镜

►

流式细胞仪

►

24孔板或培养皿

►

离心机

►

移液器

实验步骤

细胞固定

按照下表所示步骤处理贴壁细胞和悬浮细胞：

步骤	贴壁细胞		悬浮细胞	组织样本
	直接使用荧光显微镜观察	用于流式细胞术或涂片
1	吸弃培养基，用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。	用胰蛋白酶消化，收集细胞悬液。	离心收集细胞(1000 g，5分钟)，弃上清，用无血清培养基洗涤细胞3次，每次离心1000 g，5分钟。	按照冰冻或石蜡包埋流程对样本进行包埋。样本必须用4% PFA固定液进行固定。
		离心收集细胞(1000 g，5分钟)，弃上清，用无血清培养基洗涤细胞3次，每次离心1000 g，5分钟。
2	加入足量4% PFA固定液(完全覆盖细胞)，室温下固定30分钟。	加入4% PFA固定液(100 μL/106个细胞)，室温下固定30分钟	加入4% PFA固定液(100 μL/106个细胞)，室温下固定30分钟	用切片机按照流程制作5-10 μm的切片。
3	用PBS洗涤细胞3次。	用PBS洗涤细胞3次，每次离心1000 g，5分钟。	用PBS洗涤细胞3次，每次离心1000 g，5分钟。	用PBS洗涤3次。

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淬灭(可选)

►

若使用PFA固定，可加入含1.5 mg/mL甘氨酸的PBS溶液，室温下孵育10分钟，以减少PFA残留对后续步骤的干扰。

►

用PBS洗涤细胞3次。

菲律宾菌素III染色

工作液配制

►

从-20℃取出Filipin III储存液（1 mg/mL），室温下平衡至少15分钟。

►

用PBS将储存液稀释至工作浓度，一般情况下细胞样本为50μg/mL，组织样本为500μg/mL。

浓度优化：建议进行梯度浓度测试（25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL），选择信号强度与背景比最高的浓度。

染色

按照下表所示步骤处理贴壁细胞和悬浮细胞的染色，注意全程避光操作。

步骤	贴壁细胞样本	细胞悬液	组织样本
1	吸弃PBS	离心1000 g，5分钟，吸弃PBS	吸弃PBS
2	加入适量Filipin III工作液（50μg/mL），完全覆盖细胞。	加入100 μL Filipin III工作液(每106个细胞)	加入适量Filipin III工作液（500μg/mL），完全覆盖组织。
3	室温下避光孵育1小时	室温下避光孵育1小时	室温下避光孵育2小时
4	用PBS洗涤细胞3次。	用PBS洗涤细胞3次，每次离心1000 g，5分钟。	用PBS洗涤细胞3次。

孵育时间优化：对新的实验体系建议进行梯度时间测试（30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时），选择信号稳定且无明显淬灭的时间点

若需进行多色染色，建议在Filipin III染色后进行其他荧光标记，且需验证荧光染料光谱与Filipin III的兼容性。

封片（可选）

►

细胞悬液和组织样本可以制成涂片或切片。

►

吸弃洗涤液，滴加10-20 μL抗淬灭封片剂(Prolong Gold或Vector Shield)于载玻片或培养皿上。

►

轻轻覆盖盖玻片，避免产生气泡。

►

将玻片置于4℃避光保存，建议在24小时内完成成像，以避免荧光淬灭。

结果检测

方法	显微镜观察	流式细胞术检测
样本	贴壁细胞、细胞悬液、组织切片	细胞悬液
设备	荧光显微镜或共聚焦显微镜	流式细胞仪
参数设置	激发波长：340-380 nm 发射波长：430-480 nm	激发波长：350 nm 发射波长：450 nm *与DAPI类似
检测	调整适当的曝光时间，确保信号强度适中。	使用适当的电压设置，确保信号在线性范围内。
检测	每个样本采集3-5个视野的图像。	每个样本至少检测10,000个细胞。

常见问题与解决方案

背景过亮

●

原因：非特异性结合或淬灭不完全。

●

解决方案：增加封闭步骤（1% FBS或3% BSA/PBS），延长洗涤时间或增加洗涤次数。

荧光信号弱

●

原因：染色时间不足或浓度太低。

●

解决方案：增加染色时间或提高染色浓度。

案例一 Int. J. Biol. Sci.（IF=10.0）

Filipin III的作用 检测AML-12细胞内游离胆固醇的含量和分布变化，证明了CAV1缺失会导致AML-12细胞胆固醇蓄积。

设备

共聚焦显微镜

样本

细胞悬液涂片

染料浓度

12.7 μM

孵育时间

1小时

标题 Caveolin-1 mitigates the advancement of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease by reducing endoplasmic reticulum stress and pyroptosis through the restoration of cholesterol homeostasis

客户单位 安徽医科大学

引用产品 Filipin III（B6034）

研究简介 MASLD是全球最常见的慢性肝病，可进展为纤维化甚至肝癌。Caveolin-1（CAV1）参与胆固醇转运等过程，但在MASLD进展中的具体作用机制尚不清楚。研究通过构建CAV1敲除小鼠MASLD模型、分析患者肝组织样本，并结合AML-12肝细胞体外实验进行探究。结果表明，CAV1是MASLD胆固醇稳态的关键调节因子，通过FXR/ABCG5/ABCG8通路抑制内质网应激与焦亡，减缓疾病进展。

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案例二 Nat. Metab.（IF=20.8）

Filipin III的作用 Filipin III用于显示胆固醇在小胶质细胞中的分布和含量，从而定量评估脑组织及小胶质细胞内游离胆固醇的蓄积程度。

设备

共聚焦显微镜（粉色伪彩）

样本

组织切片

染料浓度

500 μg/ml

孵育时间

2小时

标题 Cholesterol metabolic reprogramming mediates microglia-induced chronic neuroinflammation and hinders neurorestoration following stroke

客户单位 首都医科大学

引用产品 Filipin III（B6034）

研究简介 缺血性中风后慢性神经炎症是神经修复的主要障碍。本研究通过单细胞测序发现，中风后小胶质细胞持续激活，形成中风相关泡沫样小胶质细胞（SAM-foamy），其胆固醇代谢发生广泛重编程，表现为脂质滴和胆固醇晶体大量蓄积。研究进一步证实，直接向脑内注射游离胆固醇或胆固醇晶体可诱发持续性小胶质细胞激活和炎症反应。通过激活脑特异性胆固醇24-羟化酶CYP46A1，可促进胆固醇清除、减轻小胶质细胞胆固醇过载，改善小鼠的神经功能恢复。

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案例三 Immunity（IF=26.3）

Filipin III的作用 Filipin III用于标记并定量检测细胞膜（质膜）上的游离胆固醇含量，验证M2巨噬细胞、肿TAMs及25HC处理后巨噬细胞的胆固醇代谢表型。

设备

荧光显微镜（红色伪彩）、流式细胞仪

样本

组织切片

染料浓度

50 μg/ml

孵育时间

0.5小时

标题 25-Hydroxycholesterol regulates lysosome AMP kinase activation and metabolic reprogramming to educate immunosuppressive macrophages

客户单位 复旦大学、上海大学、中国科学院大学、中国科学院、上海交通大学医学院附属同仁医院、同济大学医学院附属上海市第十人民医院（排名不分先后）

引用产品 Filipin III（B6034）、FCCP（B5004）、Oligomycin A（A5588）、Rotenone（B5462）、2-deoxy-glucose（B1027）

研究简介 肿瘤相关巨噬细胞（TAM）阻碍免疫检查点治疗。研究发现，TAM中25-羟基胆固醇（25HC）大量蓄积。IL-4/IL-13通过STAT6诱导胆固醇-25-羟化酶（CH25H）表达，使25HC在溶酶体中积累。溶酶体25HC竞争结合GPR155抑制mTORC1，激活AMPKα；AMPKα磷酸化STAT6的Ser564位点增强其转录活性，促进ARG1表达和免疫抑制功能。抑制CH25H可消除TAM免疫抑制功能，增加肿瘤浸润T细胞数量和活化，与抗PD-1治疗协同增强抗肿瘤效果。

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货号	名称	用途	激发波长	发射波长或颜色
B6034	Filipin III（菲律宾菌素 III）	天然荧光多烯抗生素，特异结合非酯化胆固醇，广泛用于膜上游离胆固醇定位。	340-380 nm	430-480 nm
C8201	BODIPY‑Cholesterol	带BODIPY荧光团的胆固醇类似物，可以模拟胆固醇，用于检测细胞内固醇摄取和转移。	505nm	515nm
C8003	BODIPY 581/591 C11	荧光探针，可以结合膜脂。被氧化后由红变绿，常用于脂质过氧化成像。	还原态： 581 nm	还原态： 591 nm
C8003	BODIPY 581/591 C11	荧光探针，可以结合膜脂。被氧化后由红变绿，常用于脂质过氧化成像。	氧化态： 488 nm	氧化态： 510 nm
B8209	Nile Red（尼罗红）	脂滴红色荧光探针，检测细胞内中性脂和脂滴。	552 nm	636 nm
A4664	BODIPY 493/503	绿色BODIPY小分子染料，特异标记细胞内中性脂质/脂滴，谱线窄，利于多重染色。	493 nm	503 nm
C8593	BODIPY 500/510 C1, C12	BODIPY染料，脂滴类染料，穿膜后特异定位于细胞内中性脂类，适合脂滴成像。	500 nm	510 nm
A4715	Oil Red O（油红O）	中性脂和胆固醇染色的脂溶性偶氮染料，不是荧光染料。可做脂肪变性、脂滴负荷分析。	非荧光染料	红色
B8804	DiI（橙红细胞膜染料）	亲脂性橙红色荧光探针，可以插入细胞膜和脂质双层，常用于细胞膜标记。	549 nm	565 nm
B8806	DiR（近红外细胞膜染料）	DiI的近红外衍生物，亲脂性，标记细胞膜和脂蛋白，组织穿透深、背景低，适合体内近红外成像。	748 nm	780 nm (近红外，不可见)

APExBIO未独立实验确认以上方法的准确性，仅供参考。

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