标题

Lipid asymmetry disruption by XKR8 orchestrates neutrophil extracellular trap formation and inhibits fungal infection

 

客户单位  安徽医科大学、武汉大学中南医院、安徽医科大学第一附属医院、华中科技大学同济医学院（排名不分先后）

 

引用产品  

 

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Q-VD-OPh（A1901）

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U0126（A1337）

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Z-VAD-FMK（A1902）

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GW5074（B1405）

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DPI（B6326）

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EGTA-AM（C4548）

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apocynin（B3675）

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doxorubicin（A1832）

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staurosporine（A8192）

 

 

 

 

（DOI: 10.1038/s41590-026-02456-z）

为了明确脂质翻转与NET形成的关联，并筛选介导脂质翻转的关键酶，研究人员用PMA处理中性粒细胞，诱导NET形成，检测PS外翻与NET形成时序。结果显示，PS外翻发生在NET形成之前。研究人员构建敲除XKR8和TMEM16F的细胞和小鼠模型，对比脂质翻转、NET形成及中性粒细胞其他功能；随后用A23187（B6646）补充刺激，验证非PMA特异性场景下的NET形成；同时用STS（A8192）诱导凋亡，验证XKR8的功能。结果显示，敲除XKR8的细胞和小鼠在PMA和A23187刺激下均完全丧失PS外翻与NET形成能力，敲除TMEM16F无影响。WT中性粒细胞经STS诱导后PS外翻率显著升高，而敲除XKR8的中性粒细胞经STS诱导后PS外翻率极低。XKR8缺失不干扰中性粒细胞发育、脱颗粒及吞噬功能。以上结果说明，脂质翻转是NET形成的早期事件，XKR8是介导该过程的关键酶。

为了探究XKR8的上游激活信号，明确NET形成中XKR8的激活机制，研究人员检测PMA刺激下敲除的XKR8细胞的ROS、PKC/MAPK通路的标志物，同时用流式细胞术、免疫印迹等方法分析Caspase家族激活情况。结果显示，XKR8敲除不影响上游ROS及PKC/MAPK通路，仅Caspase-3被特异性激活。随后研究人员用Q-VD-OPh（A1901）、Z-VAD-FMK（A1902）抑制Caspase，用DPI（B6326）、apocynin（B3675）抑制ROS生成，用U0126（A1337）、GW5074（B1405）阻断PKC/MAPK通路，同时，在小鼠体内敲除Caspase-3验证其在XKR8激活中的作用。结果显示，抑制或敲除Caspase-3可以阻断PS外翻与NET形成，ROS抑制剂可抑制Caspase-3激活和NET形成。阻断PKC/MAPK通路直接阻断WT中性粒细胞NET形成，但不影响XKR8敲除细胞的上游通路激活状态。以上结果表明，ROS作为起始信号激活Caspase-3，Caspase-3再激活XKR8，而PKC/MAPK通路是NET形成的必要上游信号，XKR8作用于该通路下游且不干扰上游信号传导。

为了明确XKR8激活的关键位点和磷脂重排范围，研究人员对小鼠XKR8上的Caspase-3切割位点进行突变（2DA），结果显示这些小鼠PS外翻与NET形成受阻。之后研究人员又给XKR8敲除细胞回补不同类型的XKR8突变体蛋白，分别用doxorubicin（A1832）诱导凋亡，用PMA或A23187（B6646）诱导NET形成，随后检测磷脂重排和质膜流动性。结果显示带Caspase-3切割位点突变的XKR8不能的恢复XKR8的功能，但其他类型的突变体都能正常发挥作用。另外，研究人员观察到NET形成伴随PS、PE外翻及PC/SM膜层转移，质膜流动性改变。以上结果说明Caspase-3对XKR8的切割是激活必要条件，XKR8激活后介导的是彻底的磷脂重排，而不只是PS外翻。

为了揭示XKR8介导脂质翻转后调控NET形成的下游信号机制，研究人员先用无钙培养基培养细胞，或者在不同时间点加EGTA-AM（C4548）螯合钙离子，验证钙离子信号的作用时序；再用Indo-1染色检测胞内钙离子水平,用Flipper-TR探针检测质膜张力变化；接着抑制中性粒细胞高表达的机械敏感型钙离子通道，用钙离子通道激动剂处理XKR8敲除的细胞，验证通道对NET形成的影响；同时用A23187（B6646）处理检测早期钙离子流入与XKR8的关联性。结果显示，在脂质翻转高峰前螯合钙离子，可以完全阻断NET形成，高峰后再螯合则没有效果。已经发生脂质翻转的中性粒细胞胞内钙离子水平会升高，敲除XKR8可以导致细胞后期胞内钙离子水平显著降低。此外，XKR8介导的脂质翻转会降低质膜张力。钙离子通道抑制剂对NET的抑制效果与XKR8敲除相似，钙离子通道激动剂可以恢复XKR8敲除的细胞的胞内钙离子水平，使NET正常形成。用A23187处理后，XKR8的敲除无法影响的早期钙离子流入水平。这些结果说明，XKR8介导脂质翻转后，会通过降低质膜张力激活机械敏感型钙离子通道，由此产生的钙离子信号，是NET形成的关键下游步骤。而且XKR8不影响早期的钙离子信号，只在脂质翻转后的钙信号放大中起作用。

为了明确XKR8介导的NET形成在无菌性炎症疾病中的病理作用，研究人员构建了肺损伤和关节炎小鼠模型，并在这些小鼠的中性粒细胞中特异性敲除或突变（2DA）XKR8，观察肺损伤与关节炎表型。结果显示，XKR8敲除和突变的小鼠肺组织中性粒细胞浸润没有变化，但NET形成量减少，肺损伤和关节炎减轻。这些结果说明XKR8介导的NET形成会加重急性肺损伤、类风湿关节炎等无菌性炎症，抑制XKR8可以减轻组织损伤。

为了探究XKR8介导的NET形成在抗真菌感染中的免疫功能及治疗潜力，研究人员构建白色念珠菌肺部和全身感染小鼠模型，观察症状并检测真菌载量，随后用TRPV4激动剂处理XKR8敲除小鼠，验证治疗效果。结果显示，中性粒细胞特异性敲除或突变XKR8小鼠感染后存活率降低，体内真菌载量升高，NET形成减少，多器官损伤加重。而TRPV4激动剂可以降低XKR8敲除小鼠肺真菌载量，缓解出血。以上结果说明，XKR8介导的NET形成是中性粒细胞抵御白色念珠菌感染的核心机制，靶向激活机械敏感型钙离子通道可以恢复XKR8缺失的小鼠抗真菌能力，这为抗真菌治疗提供了新策略。

APExBIO是本次研究中化学试剂的主要供应商之一，提供了多种用于验证各分子通路和细胞功能的关键试剂，具体产品及作用如下：