HyperScribe™ All in One mRNA Synthesis Kit Plus 2 (ARCA, 5-moUTP, T7, poly(A))
| 规格 | 价格 | 货期 | 数量 |
|---|---|---|---|
| 25rxns | ￥2736.00 | 现货 |
特色产品
- 适用于流式细胞仪和荧光显微镜检测
- 准确区分活细胞/凋亡细胞/坏死细胞
- 用于免疫印迹和质谱分析等后续操作
- 适用于30 KDa-130 KDa大小的蛋白
- 对细胞无毒性
- 步骤更简单，无需有机溶剂
- 可将信号灵敏度提高100倍
- 同时保持稳定的特异性和分辨率
- 提供更高的转录效率并抑制免疫激活
- 使用5-moUTP和Cy5-utp修饰
- 优异的扩增效率、可重复性和稳定性
- 卓越的灵敏度和准确性，操作简单
- 优化的缓冲液和T7 RNA聚合酶混合物
- 20 μL反应体系可获得更高的RNA产量
产品描述
HyperScribe™ All in One mRNA Synthesis Kit Plus 2 (ARCA, 5-moUTP, T7, poly(A))试剂盒用于在体外快速合成ARCA加帽，5-moUTP修饰，poly（A）加尾的mRNA。通过使用T7 RNA聚合酶，Cap0类似物（ARCA，货号B8175）以共转录方式被掺入mRNA 5'端，形成Cap0结构。ARCA的添加保护mRNA免于降解并确保高翻译效率。修饰核苷酸5-moUTP（货号B8061）的添加可以抑制RNA介导的先天免疫激活。经过短暂的DNase I处理以去除模板DNA后，加帽和修饰的mRNA可以利用Poly（A）聚合酶在3'端进行加尾。聚腺苷酸化（即Poly（A）尾的添加）使mRNA更加稳定并提高mRNA的翻译起始效率。
该试剂盒有诸多应用，例如体外翻译、反义RNA和RNAi实验、RNA疫苗，RNA结构和功能研究，核酶生物化学，RNase蛋白质实验和基于探针的杂交印迹。
每次标准反应为20 μL，该试剂盒可进行25次反应。对于每次的标准反应，1 μg 的对照模板可产生25-180 μg 的RNA。
产品性质
| 产品有效期 | 2年 |
| 运输条件 | 干冰 |
| 注意事项 | 操作过程请严格保证无RNA酶和DNA酶污染。 |
产品组分
| 组分 | 组分货号 | 组分规格 | 保存条件 |
|---|---|---|---|
| 5-moUTP (10 mM) | B8061S1 | 25uL | -20°C |
| ARCA (60 mM) | B8175S1 | 35uL | -20°C |
| ATP Solution (100 mM) | K1043 | 100uL | -20°C |
| ATP (20 mM) | K1043S1 | 50uL | -20°C |
| GTP (20 mM) | K1044S1 | 25uL | -20°C |
| CTP (20 mM) | K1045S1 | 50uL | -20°C |
| UTP (20 mM) | K1048S1 | 37.5uL | -20°C |
| RNase-free H2O | S0223 | 0.5mL | -20°C |
| Nuclease - free Water | S0223 | 2x1mL | -20°C |
| T7 RNA Polymerase Mix | S0248 | 50uL | -20°C |
| 10X Reaction Buffer | S0249 | 50uL | -20°C |
| Control Template(0.5 ug/uL) | S0254 | 5uL | -20°C |
| E-PAP (2 units/uL) | S0255 | 100uL | -20°C |
| 5X E-PAP Buffer | S0256 | 600uL | -20°C |
| 25 mM MnCl2 | S0257 | 250uL | -20°C |
运输条件:干冰 产品有效期:2年 | |||
操作说明
常见问题
1. Q：RNA产物片段大于预期？
A：如果电泳显示产物条带大于预期，可能原因：①质粒模板可能没有完全线性化；②有义链3’端为突出结构；③RNA存在未完全变性的二级结构。建议确认模板结构，并将电泳方式由琼脂糖胶换成变性胶来检测RNA产物。
2. Q：RNA产物片段小于预期。
A：如果电泳显示产物条带小于预期大小，可能原因：①模板序列中包含类似于T7 RNA聚合酶的终止序列；②模板中GC含量高形成高级结构；③RNase污染。不同的聚合酶识别不同的终止序列，若是模板中含终止结构，建议尝试不同的RNA聚合酶。如果模板为高GC，建议加入SSB蛋白，以提高转录效率。出现产物条带与预期不一致，请跑变性胶检测产物。
3. Q：产物电泳拖尾现象。
A：电泳过程中有拖尾现象，可能原因：①实验操作过程被RNA酶污染；②DNA模板被RNase污染。体系中的RNA酶抑制剂只能抑制痕量的RNA酶残留，建议重新纯化模板DNA，并在实验过程中使用RNase-free的枪头和EP管，佩戴一次性乳胶手套和口罩，所有试剂均用RNase-free H2O配制。
4. Q：模板中间有一段Poly T中止序列，后面的序列可以转录出来吗？
A：模板中有发卡结构会影响转录，序列一般不会影响转录。
5. Q：模板一定要是双链吗？
A：至少T7启动子要是双链的。
6. Q：合成的RNA如何纯化？是否有配套的过柱纯化盒子？
A：可使用RNA Clean and Concentrator Kit (K1069)进行RNA纯化，或使用Oligo (dT) 25 Beads (K1306/K1307)纯化带有polyA尾巴的mRNA。
7. Q：使用线性化的质粒时，线性化质粒的方法有哪些？
A：酶切（注意选择酶切位点时不要选择3’端突出的酶切位点）、PCR（得到PCR产物，若模板没有T7启动子和poly A序列，可在PCR的正向和反向引物中分别引入）。
8. Q：使用质粒作为模板时，在线性化的过程中，为什么需要使用平末端或者5’突出末端的限制性内切酶进行线性化？
A：原因和环状质粒为模板相似，都是会因为没有终止子而无限循环下去，从而导致生成的产物片段大小不一。
9. Q：sgRNA条带模糊。
A：sgRNA是100 nt左右的单链RNA，在水溶液中容易形成二级结构，因此电泳时会位置会发生变化，采用加速冷冻或者甲酰胺变性凝胶电泳可以改善电泳结果。
10. Q：体外转录试剂盒适用的片段范围是多少？
A：最小做过100 bp左右的sgRNA，最大做过10 kb (自复制RNA)。
11. Q：针对大片段和小片段，转录的效率如何？
A：大片段会出现条带弥散的情况，因为片段越长酶越容易从模板上脱落，所以得到的产物条带就不是那么集中，其他同类公司的产品也会出现类似的情况。短的模板小于300nt的，较短的转录其实对反应有抑制作用，所以要适当延长反应时间，可以过夜16 h。因为模板和酶进行结合时识别启动子的过程需要时间，所以模板太短时会对反应造成抑制作用，同时建议增加模板量至2 μg。
12. Q：模板中存在高级结构（高GC或是茎环结构），怎么做可以提高产量？
A：提高温度，如果有很多高级结构存在可以建议加入SSB蛋白。
13. Q：模板中存在类似于T7终止序列（也是一种茎环结构）怎么做可以提高产量？
A：降低反应温度。
14. Q：产物纯化方式比较。
A：酚/氯仿抽提的优点是便宜，但是有可能会残留游离的核苷酸。柱提法优点可以将游离的核苷酸去除干净，但价格相对较贵。切胶回收的方法得到的产物更加均一。磁珠法优点是快速且回收效率高，可达到90%以上。
15. Q：转录反应得到的产物量较低可能的原因及建议。
A：(1) 产物长度小于300 nt时，建议提高产物的投入量至2 μg，适当延长反应时间。
(2) 阳性对照，试剂盒中提供的阳性模板大小在1000 bp左右，对于阳性对照的实验设计可以在选择反应2 h后从20 μL的体系中取出5-10 μL确定产量，剩下的体积继续反应至实验组的反应时间相同后确定产量。
(3) 不同的纯化方式产生的损失是不同的。
(4) 可以重新纯化模板。
(5) 确定模板定量以及其完整性。
(6) 尝试其它的启动子和RNA聚合酶。
16. Q：模板投入量增加为2 μg时，NTP的量以及DNA酶的量是否需要调整？
A：模板投入量增加为2 μg时，NTP的量不用调整，若担心模板消化不彻底，可将DNA酶的量从1 μL提高至3 μL。
17. Q：对照组投入0.5 μg产出是多少？
A：Control Template的长度约1000 bp，投入0.5 μg，根据老款和升级款kit不同，产出约50-150 μg范围。
18. Q：T7启动子TATA后面带有三个GGG的作用是什么？
A：GGG的作用是提高转录效率的。
19. Q：体外转录的试剂盒组分中有预混RNase抑制剂吗？
A：试剂盒所用的T7 RNA Polymerase Mix已包含RNase抑制剂以及焦磷酸酶等，内部RNA 酶抑制剂只能抑制少量RNA酶残留，建议实验过程中严格遵守RNase-free操作。
沪公网安备 31011002003500