期刊 Advanced Composites and Hybrid Materials

IF值 15.5

DOI 10.1007/s42114-026-01689-8

近日，以河北医科大学向柏、王磊团队为主，联合澳门大学欧阳德方等研究者在材料科学领域知名期刊Advanced Composites and Hybrid Materials发表研究，针对mRNA肝外递送与脾脏偏向转染难题，提出“氯喹启发的脾脏靶向系统（chloroquine-inspired spleen-targeting system, CISTS）”。该研究将氯喹样喹啉药效团与可电离脂质设计相融合，通过分子杂交与组合筛选获得一系列新型脂质纳米颗粒，在不额外加入靶向配体或外源免疫佐剂的情况下，实现脾脏偏向性 mRNA 表达、增强内体/溶酶体逃逸，并产生与TLR通路相关的自佐剂效应。

本文所用关键工具mRNA包括EGFP mRNA、OVA mRNA、Fluc mRNA和Cas9mRNA由APExBIO提供。四类mRNA分别用于体外蛋白表达/转染观察、肿瘤抗原疫苗验证、体内生物发光分布以及长片段载荷兼容性评价；其长度从 1.0到4.5 kb范围。对于mRNA-LNP研究，高质量mRNA原料会直接影响包封率、完整性、翻译效率和批间一致性，是关键上游变量之一。

图1. CISTS 的总体设计与抗肿瘤免疫机制示意图

（CIL/LNP 筛选、脾脏偏向性抗原表达及 T 细胞介导的抗肿瘤效应）

本研究的核心特色在于从可电离脂质化学结构本身出发，同时调控器官偏向性、胞内递送与免疫刺激。主要创新可概括为：

图2. 氯喹启发脂质CIL-A–E的模块化合成路线

研究团队利用微流控平台制备了180种化学组成不同的LNP（5 种CIL×36种配方组合），先以粒径、PDI等指标筛选，再对 31个候选配方进一步进行RNA定量，最终选出5个代表性优选配方并命名为CISTS-A至CISTS-E。CISTS可包载EGFP（996 nt）、OVA（1416 nt）、Fluc（1921 nt）和 Cas9（4521 nt）mRNA；其粒径约100–200 nm、PDI<0.3、ζ电位约−1至 −10 mV，包封率约70%–100%。4 °C储存7 d后主要理化指标变化较小，提示良好的短期胶体稳定性。

图3. CISTS 的 LNP 配方筛选策略与组分比例设计

图4. CISTS-A–E的代表性TEM/cryo-EM形貌

体外实验涉及DC2.4、293T、B16F10和B16F10-OVA等细胞。EGFP mRNA用于观察蛋白表达；Cy5标记EGFP mRNA与 LysoTracker联合成像用于评价mRNA与酸性内体/溶酶体区室的空间关系。与MC3-LNP对照相比，CISTS处理后可见溶酶体信号减弱、胞内Cy5-mRNA与EGFP表达增强，时间序列成像结果与更有效的内体/溶酶体逃逸及胞质释放相一致。需要注意，这类共聚焦结果主要提供间接证据，若进一步开发平台，可结合Galectin-8 recruitment、胞质RNA定量或亚细胞分级等方法对内体逃逸进行定量验证。

图5. Fluc mRNA/CISTS体内给药与IVIS成像流程

图6. 静脉给药后主要器官Fluc生物发光及脾/肝表达比

（ 显示CISTS的脾脏偏向性表达）

脾脏偏向性验证：研究者首先在BALB/c小鼠中比较皮下、肌肉和静脉给药；其中静脉注射Fluc mRNA/CISTS后6 h的IVIS成像显示明显的脾脏偏向性表达。与MC3、SM102、ALC0315及 SORT对照相比，CISTS组的脾/肝表达比显著提高；其中 CISTS-C、D、E的脾脏生物发光占总器官信号比例约为 66.69%、67.62%和54.71%。因此更准确的表述是“脾脏偏向性转染/表达”，而非已证明对某一脾脏细胞亚群的配体介导精准靶向。

免疫激活验证：CISTS/OVA mRNA可增强OVA特异性T细胞反应，并提高IFN-γ⁺ CD8⁺ T细胞等免疫指标；脾脏和肿瘤组织 RNA-seq显示抗原呈递、T/B细胞信号、IFN相关基因以及TLR 通路被激活，同时多种Th1相关细胞因子/趋化因子上调。分子对接进一步提示CIL与TLR4-MD2、以及喹啉头基与TLR7存在潜在相互作用，为自佐剂机制提供结构层面的计算支持。

抗肿瘤疗效验证：预防、治疗和肺转移三个场景得到验证

图7. 治疗后肿瘤组织 H&E、Ki67 与 TUNEL 分析（用于评价坏死/组织学改变、增殖及凋亡）

图8. 肿瘤组织CD4⁺/CD8⁺ T细胞浸润的免疫荧光分析

安全性验证：在本研究给药条件下，多数组别小鼠体重总体稳定，主要脏器组织学未见明显异常，血液学及肝、肾、心肌相关生化指标总体未见显著毒性信号。现有数据支持CISTS-C/D/E等优选配方在该小鼠剂量与观察窗口下具有较好的初步耐受性，长期重复给药、细胞因子释放、补体激活及大动物安全性仍需进一步评价。

本研究首次将氯喹骨架引入可电离脂质设计，通过模块化杂交策略构建了兼具脾脏靶向递送、高效内体逃逸和自佐剂活性的CISTS平台。该平台无需额外添加靶向配体或免疫佐剂，即可实现mRNA的脾脏偏向性递送并激活强效Th1型抗肿瘤免疫应答，在小鼠黑色素瘤预防、治疗及肺转移模型中均展现出显著疗效。多种 mRNA 载荷、体外细胞、器官成像、免疫分析以及三类肿瘤模型形成了较完整的证据链，证明该体系具备从材料设计向肿瘤 mRNA 疫苗应用延伸的潜力。CISTS为mRNA疗法的肝外靶向递送和肿瘤免疫治疗提供了一种“即插即用”式的全新解决方案，具有广阔的临床转化前景。但其临床转化仍需进一步解决跨物种器官趋向性、长期安全性、规模化工艺与机制定量验证等问题。

从实验试剂角度看，稳定、可重复的高质量mRNA是贯穿整套研究的重要基础。本文使用APExBIO提供的OVA（R1027）、Fluc（R1018）、Cas9（R1015）与EGFP mRNA（R1016、R1011），分别支撑抗原疫苗、体内分布、长片段载荷兼容性和体外表达等关键实验。