文中CAF细胞培养使用到的抗坏血酸钠（Sodium ascorbate，B1834）由APExBIO提供。

食管鳞状细胞癌（ESCC）是一种高发消化道恶性肿瘤。目前PD-1抑制剂联合化疗/放化疗的新辅助免疫治疗是局部晚期ESCC的标准治疗方案，但大部分患者会出现原发耐药，或是初始有效后复发。因此临床亟需可靠的生物标志物，用来筛选获益人群、优化治疗策略。现有的免疫治疗疗效生物标志物存在明显局限：组织类标志物在ESCC中存在显著的空间与时间异质性，预测效能有限，而血液类标志物缺乏机制研究和临床验证。

近日，来自中国医学科学院、南京医科大学、华中科技大学同济医学院的研究团队在《Cancer Discovery》（IF=33.3）发表研究，揭示CAF-Epi/IGF1/SOX2/GPNMB介导食管鳞癌免疫治疗耐药的完整分子机制，为鳞癌免疫个体化治疗效果预测提供了新的生物标志物。

为了筛选能够预测食管鳞癌新辅助免疫化疗（NCIT）疗效的血浆生物标志物，研究人员对91例患者的治疗前血浆开展LC-MS/MS蛋白组检测，再通过ELISA验证血浆GPNMB水平，并结合治疗应答结果、肿瘤大小变化、总生存期及治疗前后配对血浆样本进行关联分析。结果显示，免疫治疗无应答者的血浆可溶性GPNMB水平显著升高，统计学显著性在所有差异蛋白中最高；血浆GPNMB水平越高，患者治疗后肿瘤残留体积越大、总生存期越短；治疗后应答者的血浆GPNMB水平显著下降，无应答者则持续升高，治疗期间GPNMB水平上升与疾病进展、生存期缩短显著相关。综上所述，血浆GPNMB既可作为ESCC免疫治疗的疗效预测标志物，也可用于治疗过程中的动态疗效监测，适用于患者分类与实时疗效评估。

为了明确GPNMB调控CD8+T的机制，研究人员分析了31例未接受过针对性治疗的ESCC患者配对外周血与肿瘤组织中GPNMB水平与CD8+T细胞亚群的相关性；同时分离患者原代CD8+T细胞，经GPNMB处理、SDC4抗体阻断处理后，与肿瘤细胞共培养，检测T细胞杀伤活性，并进行Co-IP检测和转录组测序，最终通过荷瘤小鼠模型完成体内验证。结果显示，血浆GPNMB水平越高，耗竭型CD8+T细胞（PD-1+LAG-3+、PD-1+TIM-3+）占比越高，效应型CD8+T细胞（IFNγ+、GZMB+）占比越低；GPNMB处理可诱导CD8+T细胞耗竭、削弱其肿瘤杀伤能力，而阻断SDC4受体后，该抑制效应完全消失，GPNMB可促进SDC4招募CD148，进而抑制TCR下游信号通路；体内实验证实，外源性给予重组GPNMB会加速肿瘤生长，减少瘤内CD8+T细胞浸润、降低其效应功能并加重耗竭。综上所述，GPNMB通过SDC4-CD148轴抑制TCR信号传导，驱动CD8+T细胞功能耗竭，最终削弱抗肿瘤免疫应答、导致免疫治疗耐药。

为了明确ESCC中GPNMB的细胞来源，并区分膜结合型与可溶性GPNMB的免疫调控功能差异，研究人员通过mIF定位GPNMB的细胞分布；构建GPNMB基因过表达和敲低的肿瘤细胞系，结合OVA抗原特异性共培养体系检测CD8+T细胞功能。通过siRNA敲低或使用GI254023X抑制ADAM10（GPNMB的剪切酶），阻断膜结合型GPNMB的胞外段脱落；同时利用4-NQO诱导的原位ESCC小鼠模型、食管上皮特异性GPNMB敲除小鼠完成体内验证。结果显示，GPNMB主要在肿瘤上皮细胞中表达。肿瘤细胞过表达GPNMB可抵抗CD8+T细胞杀伤、诱导T细胞耗竭，敲低GPNMB则增强CD8+T细胞杀伤效应。抑制ADAM10可阻断GPNMB胞外段剪切，提升细胞膜结合型GPNMB水平，减少可溶性GPNMB向胞外释放，同时恢复CD8+T细胞杀伤功能、减轻细胞耗竭程度。食管上皮特异性敲除GPNMB可显著降低小鼠肿瘤负荷、延长生存期、下调血清GPNMB水平。综上所述，抑制CD8+T细胞功能并介导免疫治疗耐药的主要是肿瘤细胞分泌的可溶性GPNMB，而膜结合型GPNMB无显著免疫抑制作用。

为了解析ESCC中GPNMB表达上调的转录调控机制，研究人员整合全基因组测序、DNA 甲基化测序、转录因子预测、单细胞转录组等多类外部数据，筛选GPNMB上游调控因子；随后敲低或过表达候选基因，结合ChIP-qPCR、荧光素酶报告实验验证直接调控关系，同时使用GPNMB中和抗体，在体内外模型中验证该调控轴的免疫效应。结果显示，CNV、启动子甲基化改变均不上调GPNMB表达；SOX2与GPNMB表达相关性最强，在肿瘤细胞中显著高表达，对应患者预后更差。敲低SOX2可显著降低GPNMB表达，SOX2能直接结合GPNMB的启动子区域，激活其转录。过表达SOX2的肿瘤细胞可抵抗CD8+T细胞杀伤、诱导T细胞耗竭，而加入GPNMB中和抗体后，该效应被部分逆转，小鼠体内实验也证实SOX2的促肿瘤生长作用依赖GPNMB。综上所述，SOX2通过转录激活GPNMB的表达，导致CD8+T细胞功能紊乱，抑制肿瘤免疫。

CAF-Epi单元是肿瘤组织中由癌相关成纤维细胞（CAF）和肿瘤上皮细胞（Epi）构成的微环境结构。为了探究肿瘤微环境中CAF-Epi对SOX2-GPNMB轴的空间调控机制，研究通过空间转录组分析，明确CAF-Epi与肿瘤细胞SOX2表达的空间关联。构建CAF与肿瘤细胞体外共培养体系，结合IGF1中和抗体干预、IGF1R 抑制剂处理及IGF1基因敲低实验，验证分泌调控机制。采用mIF检测100例患者样本的相关指标，分析临床相关性，同时在其他鳞状细胞癌中验证该调控规律。结果显示，肿瘤细胞距离CAF-Epi越近，SOX2表达水平越高；CAF-Epi样成纤维细胞（nlCAFs）分泌IGF1，诱导肿瘤细胞上调SOX2与GPNMB表达；阻断IGF1-IGF1R通路或敲低成纤维细胞IGF1后，该诱导效应完全消失。临床样本中，免疫治疗无应答者的CAF-Epi评分、SOX2及GPNMB表达均显著升高；CAF-Epi评分越高，瘤内CD8+T细胞耗竭越显著、效应功能越弱；CAF-Epi评分与SOX2、GPNMB表达呈显著正相关，且无应答者中SOX2与GPNMB的调控关联更强。该调控规律在宫颈鳞癌、头颈部鳞癌、肺鳞癌中同样成立。综上所述，CAF-Epi分泌IGF1上调肿瘤细胞SOX2表达，进而激活 GPNMB 转录，最终加重免疫抑制微环境、驱动免疫治疗耐药，该空间调控轴在鳞状细胞癌中具有普适性。

为验证GPNMB在食管鳞癌免疫逃逸及PD-1抑制剂耐药中的作用，同时评估靶向GPNMB联合治疗的应用价值，研究采用临床相关性更高的患者来源异种移植（PDX）模型开展体内验证。研究人员首先从20例ESCC PDX模型中筛选出GPNMB高表达株与低表达株，分别接种至免疫缺陷小鼠与人源化小鼠，对比肿瘤生长特征与抗PD-1治疗应答。随后，使用同系皮下肿瘤模型、4-NQO诱导的原位ESCC模型、PD-1耐药的人源化PDX模型，评估抗GPNMB抗体单药及联合抗PD-1抗体的治疗效果。免疫缺陷小鼠的成瘤结果显示，GPNMB高、低表达株的肿瘤生长速度无显著差异，说明GPNMB本身不直接促进肿瘤细胞增殖。人源化小鼠的治疗结果显示，GPNMB高表达PDX肿瘤生长速率更快，血清中人源可溶性GPNMB水平更高，且完全耐受抗PD-1的单药治疗，说明GPNMB的促瘤效应依赖免疫系统。三种治疗模型的验证结果显示，抗GPNMB抗体与抗PD-1抗体联合用药，在皮下瘤、原位癌及耐药PDX模型中均可显著抑制肿瘤生长、延长荷瘤小鼠生存期，疗效均优于单药治疗；联合治疗可显著提升瘤内CD8+T细胞的浸润水平、活化程度与杀伤功能。综上所述，GPNMB可驱动ESCC发生免疫逃逸，介导PD-1抑制剂耐药；靶向抑制GPNMB可有效恢复肿瘤对PD-1阻断治疗的应答。

为了构建并验证可用于临床的ESCC免疫治疗疗效多模态预测体系，研究人员收集了患者基线配对内镜活检组织、血浆样本与临床病理数据，通过单因素逻辑回归筛选独立预测指标，融合cTNM分期、CAF-Epi评分、血浆GPNMB浓度构建CANP模型，借助SHAP量化各指标重要性，采用含43名患者的既往数据集训练模型，再利用27例临床试验里同步入组的患者数据校验模型预测能力、分层患者生存风险。结果显示，cTNM分期、血浆GPNMB浓度、CAF-Epi评分均可独立预判免疫治疗疗效；融合三类指标的CANP模型区分能力优于单一指标或两项指标组合。SHAP结果证明cTNM权重最高，血浆GPNMB、CAF-Epi评分权重依次降低；高分CANP分组患者总生存期明显缩短，模型可清晰划分不同预后人群。综上所述，上述CANP多模态模型能稳定预测ESCC患者的免疫治疗应答与生存结局，可用于临床转化。

本研究阐明了食管鳞癌免疫治疗耐药的核心调控通路：肿瘤微环境中CAF-Epi分泌IGF1，上调肿瘤细胞SOX2表达；SOX2直接转录激活GPNMB；肿瘤细胞分泌的可溶性GPNMB进入血液后，通过SDC4-CD148通路抑制CD8+T细胞TCR信号，诱导T细胞功能耗竭，最终导致PD-1抑制剂耐药。

基于上述机制，研究证实了血浆GPNMB可作为生物标志物无创预测免疫治疗疗效，同时整合血浆GPNMB水平、组织CAF-Epi特征与临床病理因素，构建了多模态CANP模型。该模型可稳定预测免疫治疗应答与患者生存，用于食管鳞癌精准免疫治疗。

APExBIO还可以提供以下本研究中使用过的化合物：

APExBIO还可以提供以下生化实验常用的小分子试剂：