研究团队用生物素标记的PROTAC探针，对LNCaP细胞膜蛋白做生物素下拉实验，再通过质谱和Western blot鉴定结合蛋白。实验结果证实CD36是探针结合的主要膜蛋白，还检测到内吞相关蛋白。SPR检测显示，PROTAC探针与CD36的结合亲和力，高于CD36的天然配体棕榈酸。后续用无生物素标记的同源PROTAC做竞争结合实验，发现它能抑制探针与CD36结合，证明结合特异性。综上所述，CD36是PROTAC的特异性膜靶点。

研究团队在LNCaP、22Rv1、HCC1806细胞中用shRNA敲低CD36，再通过Western blot、UPLC-MS、MTT和克隆形成实验检测PROTAC作用。CD36敲低后，PROTAC在细胞内浓度下降，无法降解靶蛋白或抑制癌细胞生长。过表达CD36则能恢复PROTAC的作用。敲低内吞关键分子EEA1/Rab5，PROTAC的作用也减弱，说明PROTAC依赖EEA1/Rab5内吞级联。裸鼠肿瘤实验中，PROTAC能抑制对照组肿瘤生长，对CD36敲低组无效。且常规小分子药物紫杉醇不依赖CD36，证明这是PROTAC特有途径。综上所述，CD36介导的、依赖EEA1/Rab5的内吞，是PROTAC入胞的必需途径，决定其体内外活性，且与传统药物被动扩散不同。

研究团队以荧光素标记的PROTAC为探针，并以低分子量荧光探针作为对照，通过共聚焦显微镜观察正常细胞、CD36敲低细胞、EEA1敲低细胞及Rab5敲低细胞中探针的荧光强度与定位。实验结果显示，PROTAC荧光探针在孵育30分钟内即可实现细胞内定位；而当CD36、EEA1或Rab5被敲低后，细胞内探针荧光几乎完全消失，对照探针的细胞摄取则不受影响。进一步研究中，将同源PROTAC与荧光探针共孵育，发现同源PROTAC可竞争性抑制荧光探针的细胞摄取，证实PROTAC与CD36结合的特异性。研究团队还观察到PROTAC荧光探针与早期内体标志物EEA1存在共定位，且该现象在CD36敲低后消失。此外，延长PROTAC探针的linker或增加其分子量，均未影响CD36介导的内吞过程，说明该摄取机制不受药物分子量限制。综上所述，CD36介导的内吞是PROTAC实现快速细胞摄取的核心机制，且该机制不依赖药物分子量。

研究团队用无活性PROTAC荧光探针实验，同时选取多种非PROTAC超规药物（如Navitoclax（A3007）等），处理正常、CD36敲低、CD36过表达的22Rv1、HCC1806细胞并进行做MTT活力检测。结果显示，无活性PROTAC荧光探针摄取仍依赖CD36、EEA1及Rab5。所有超规药物在CD36敲低后毒性显著降低，过表达CD36可恢复活性，而常规药物紫杉醇无此现象。综上所述，CD36介导的内吞非PROTAC特有，它适用于多种结构、靶点和分子量的超规药，且在不同肿瘤细胞中保守。

研究团队在MZ1（VHL 依赖型 BRD4 PROTAC）的VHL配体羟基位点连接了带负电、带正电的及疏水中性的基团，构建出各种MZ1衍生物。SPR结果显示带负电的和疏水中性的衍生物与CD36的结合亲和力显著高于MZ1，而带正电的衍生物与CD36的亲和力极低。通过Western blot检测BRD4降解效率、UPLC-MS检测细胞内药物浓度、MTT法检测细胞毒性，结果显示这些MZ1衍生物对BRD4的降解效率更高，细胞内药物浓度显著提升；而当CD36被敲低后，衍生物的细胞摄取量明显下降。分子对接模拟结果显示，带负电衍生物和疏水中性衍生物的结合模式均能增强与CD36的亲和力。综上所述，依据CD36的结构特征对PROTAC进行前药修饰可特异性增强PROTAC与CD36的结合亲和力，提升摄取效率与生物活性，同时能避免对PROTAC原有降解机制的干扰。

研究团队对ARV-110（CRBN依赖型AR PROTAC），采用了与MZ1相同的前药修饰策略，同时合成荧光标记的MZ1衍生物探针，通过共聚焦显微镜观察其细胞摄取情况。在MCF7、22Rv1两种细胞中，检测ARV-110修饰类似物对靶蛋白AR的降解效率，发现与此前MZ1衍生物相关实验相似的规律：修饰后的ARV-110类似物，与CD36的结合及细胞摄取效率提升，对AR的降解活性也显著增强。这表明，靶向CD36的结构优化策略具有普适性，可推广至不同E3连接酶配体、不同靶蛋白的PROTAC中。

研究团队通过MTT检测MZ1及其优化衍生物在HCC1806、22Rv1细胞中的IC90值。结果显示优化后的MZ1衍生物IC90值较MZ1显著降低，细胞毒性大幅提升。CD36敲低后，衍生物的细胞活性明显减弱，说明其毒性依赖CD36介导的摄取。给异种移植HCC1806和22Rv1的裸鼠模型腹腔注射予MZ1或优化衍生物，监测肿瘤体积与小鼠体重，并通过免疫组化检测肿瘤组织中BRD4降解情况及CD36表达水平。结果显示优化衍生物对HCC1806移植瘤的生长抑制作用显著强于MZ1，且未影响小鼠体重。免疫组化结果表明，优化衍生物处理组的肿瘤组织中BRD4降解更彻底，而CD36表达无显著变化。综上，靶向CD36的结构优化可在体内外同步显著提升PROTAC的抗肿瘤活性，且不增加系统毒性，其核心机制源于CD36介导的药物摄取增强。

本研究发现CD36是超规小分子（543–2145 Da）的关键内吞受体，破解了超规药物研发中的药物通透性、溶解度与稳定性的拮抗难题。展望需优化不同PROTAC结构适配CD36，探索其他细胞内吞受体，利用CD36改善药物跨生理屏障递送，推动精准医疗转化。可以针对不同结构PROTAC优化CD36结合修饰，利用CD36改善药物跨血脑、皮肤等屏障递送，进一步推动临床转化。细胞类型依赖的内吞下游通路差异和更多内吞受体仍然有待研究。