肿瘤来源的细胞外囊泡（tEVs）在肿瘤进展和治疗耐药中起关键作用，但现有方法难以解析其分泌动态和响应治疗的cargo变化。传统EV分析无法区分“新生EVs”与“pre-existing EVs”，缺乏时间分辨率和细胞特异性。近日，厦门大学化学化工学院化学生物学系等研究团队在《J Am Chem Soc》发表题为“Profiling Nascent Tumor Extracellular Vesicles via Metabolic Timestamping and Aptamer-Driven Specific Click Chemistry”的突破性研究文章，从如何在时间和细胞特异性层面，精准捕获并分析刺激后新分泌的 tEVs（如免疫治疗后的动态变化）角度进行了全新的探索。

【期刊】J Am Chem Soc

【IF值】14.4

【DOI】10.1021/jacs.5c01973

APExBIO团队为本文的实验研究提供了高品质的4%多聚甲醛产品：Paraformaldehyde (4％) (Cat. No：K4640)

肿瘤来源的细胞外囊泡（tEVs）在肿瘤进展和治疗耐药中起关键作用，但其分泌动态和响应治疗的cargo变化难以解析。传统EV分析方法（如超速离心、亲和富集）仅能检测总EVs，无法区分新生EVs与pre-existing EVs，且缺乏细胞特异性（如肿瘤细胞靶向）。代谢标记法虽能标记新生EVs，但无法排除非肿瘤细胞背景干扰；传统点击化学特异性不足。在免疫治疗（如PD-L1抗体）中，肿瘤可能通过EV分泌双向适应策略（如同时促进免疫抑制与敏感通路），但现有技术无法实时监测新生tEVs的动态变化及分子特征，亟需开发兼具时间分辨和细胞特异性的EV分析工具。

Scheme免疫治疗期间新分泌的肿瘤细胞外小泡捕获及蛋白质组分析的STAMP策略示意图

为验证适体驱动的点击化学反应是否优于直接点击化学，解析其动力学与热力学特性，使用SYL3C适体-DBCO（靶向EpCAM）和5T-DBCO（非靶向对照），与代谢标记的MGL A375 EVs反应，通过流式细胞术检测结合曲线、荧光强度及SSB竞争实验。结果发现，适体驱动反应呈双阶段动力学，结合亲和力（K₁=6.2 nM）和反应速率（k₂/K₁）显著高于直接点击，且仅在EpCAM+且叠氮标记的EVs上特异性结合。

Fig.1 适体辅助特异性点击化学结合机制的表征

为验证微流控芯片对标记EVs的捕获效率与选择性，使用了体外制备MGL A375/U251 EVs，用生物素-适体-DBCO标记后，通过链霉亲和素修饰的人字形芯片捕获，荧光酶免疫分析及电镜观察形态。结果发现，芯片可高效捕获EpCAM+叠氮标记EVs（荧光强度比非靶向EVs高131-227倍），且释放后的EVs保持完整，适合蛋白质组分析。

Fig.2 利用体外甘露糖受体C型1进行标记物特异性细胞外囊泡的微流控选择性分离

为在肿瘤小鼠模型中验证STAMP对新生tEVs的检测能力及与肿瘤进展的相关性，使用给4T1肿瘤小鼠注射Ac₄ManNAz和PD-L1抗体，检测血浆中新生EpCAM+CD63+EVs水平，分析其与肿瘤体积的相关性。结果发现，新生EpCAM+EVs水平与肿瘤体积呈强正相关（R²=0.96），而总EpCAM+EVs在治疗组中失去相关性，证明新生EVs是更优生物标志物。

Fig.3 使用体内甘露糖结合凝集素（MGL）检测肿瘤细胞外囊泡（tEVs）

为鉴定PD-L1抗体治疗后新生tEVs的差异表达蛋白及功能通路，通过LC-MS/MS对比治疗与未治疗组新生EpCAM+EVs的蛋白组，GO富集分析及HSP70表达验证。结果发现，治疗后补体系统蛋白（如C3）和HSP70显著上调，HSP70+EVs水平与肿瘤体积变化呈正相关，提示肿瘤的双重免疫适应机制。

Fig.4 新生肿瘤细胞外小囊泡中蛋白质生物标志物的鉴定

为验证HSP70在EVs表面的抗肿瘤功能，体外将HSP70蛋白吸附至4T1 EVs表面，检测对肿瘤细胞增殖的影响，并在小鼠模型中观察肿瘤生长及免疫细胞浸润。结果发现，HSP70涂层EVs显著抑制肿瘤生长，促进凋亡（TUNEL+细胞增加）和CD8+ T细胞浸润，证明其增强抗肿瘤免疫的潜力。

Fig.5 4T1细胞外泌体上的热休克蛋白70包被可促进抗肿瘤免疫

本文通过STAMP技术（代谢标记结合适配体驱动点击化学）实现了对新生肿瘤细胞外囊泡（tEVs）的时空特异性捕获与动态解析，发现新生EpCAM⁺CD63⁺ tEVs水平与肿瘤体积呈强正相关（R²=0.96），而总EVs在治疗组中失去相关性，证实其作为实时治疗响应标志物的潜力。蛋白质组学分析揭示，PD-L1抗体治疗后，新生tEVs同时上调补体系统蛋白（如C3，促免疫抑制）和HSP70（促免疫激活），揭示肿瘤通过EVs分泌的双向免疫适应机制。功能实验表明，HSP70涂层EVs通过促进CD8⁺ T细胞浸润和抑制PD-L1表达，显著抑制肿瘤生长。

J Am Chem Soc.  2025 Mar 26;147(12):10737-10749. 

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