HPF（羟基苯基荧光素）是一种高特异性检测羟自由基、过氧亚硝基阴离子等高活性氧的荧光探针，广泛应用于神经科学、肿瘤治疗、细胞死亡、抗氧化、免疫与炎症、环境健康等多个科研领域。
今天我们整理了一份HPF染色实操方案，适用于细胞样本与脑组织样本，手把手教大家做HPF高活性氧检测。
实验原理
HPF（C3384）是一种高特异性的高活性氧（highly reactive oxygen species, hROS）荧光探针，自身几乎无荧光，具备良好的抗自氧化稳定性，背景干扰低。
HPF可选择性与羟自由基（·OH）、过氧亚硝基阴离子（ONOO-）等高活性氧反应，生成强荧光产物荧光素（fluorescein，C6358），荧光强度与hROS水平正相关。HPF对·OH的反应活性最高，产生的荧光强度约为与ONOO-反应的6倍，是与超氧阴离子（O₂-）、过氧化氢（H₂O₂）等其他ROS反应的100倍以上，可特异性检测以·OH为主的高活性氧。
HPF激发波长488~490 nm，发射波长515 nm，适配常规共聚焦显微镜与荧光显微镜的绿色荧光通道。
注意事项
材料与试剂
HPF检测
溶液配制
样本准备
HPF染色
结果检测
常见问题
染色后背景偏高
降低HPF浓度（如从5 μM 改为2 μM），缩短染色时间，确认缓冲液中无强氧化物。
诱导铁死亡或铜死亡后HPF染色荧光信号弱
细胞死亡诱导时间太长，样本活率太低，缩短细胞死亡诱导时间。
染色后细胞变圆，细胞状态变差
可能是HPF毒性导致，建议减少HFP浓度，缩短孵育时间。
客户案例 Nat Commun（IF=18.1）
标题
NIR-triggering cobalt single-atom enzyme switches off-to-on for boosting the interactive dynamic effects of multimodal phototherapy
客户单位 清华大学、北京大学、中国科学院
样本类型
贴壁细胞样本
前期处理
Co-SAEs/HNCS无近红外照射孵育24 h，近红外照射10 min。
HPF孵育
5 μM，30 min
研究简介
无创光疗被认为是一种极具前景的癌症治疗手段。然而，目前缺乏兼具理想组织穿透深度、可在最大化抗肿瘤效应的同时维持重要组织功能的多模式光疗制剂，严重制约了肿瘤光疗的临床应用。
本文开发了一种新型制剂，该制剂以锚定于中空氮掺杂碳球（HNCS）上的原子级分散钴单原子酶（Co-SAE）为活性核心。Co-SAE在近红外照射下可高效激活芬顿反应并放大活性氧（ROS）生成，引发金属死亡，最终实现温和热疗效应。更重要的是，Co-SAEs/HNCS不仅可以实现多模式肿瘤杀伤，其局部温和升温的机制还可以避免副作用，为头颈部肿瘤提供了一种基于单原子酶的无创治疗新方案。
HPF的作用 HPF用于检测・OH。无近红外照射时，PBS组、纯HNCS组几乎无绿色荧光，Co-SAEs/HNCS组仅有微弱荧光。近红外照射后，纯HNCS组荧光略有增强，Co-SAEs/HNCS组绿色荧光强度大幅升高。该结果直接证明，近红外可显著激活材料的胞内芬顿反应，大幅提升・OH产量，且钴单原子位点是活性中心。
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参考文献
Neurosci Res.2005 Nov;53(3):304-13.
Nat Commun. 2025 Feb 28;16(1):2058.
APExBIO未独立实验确认以上方法的准确性，仅供参考。
沪公网安备 31011002003500