HyperScript™ RT SuperMix for qPCR (with gDNA wiper)
mRNA synthesis
In vitro transcription of capped mRNA with modified nucleotides and Poly(A) tail
Tyramide Signal Amplification (TSA)
TSA (Tyramide Signal Amplification), used for signal amplification of ISH, IHC and IC etc.
Phos Binding Reagent Acrylamide
Separation of phosphorylated and non-phosphorylated proteins without phospho-specific antibody
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)
A convenient and sensitive way for cell proliferation assay and cytotoxicity assay
SYBR Safe DNA Gel Stain
Safe and sensitive stain for visualization of DNA or RNA in agarose or acrylamide gels.
Inhibitor Cocktails
Protect the integrity of proteins from multiple proteases and phosphatases for different applications.
HyperScript™ RT SuperMix for qPCR (with gDNA wiper)是基于HyperScript™ Reverse Transcriptase(货号K1071)的逆转录反应预混液。HyperScript™ Reverse Transcriptase是在M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase基础上经过基因工程改造后获得的全新逆转录酶,相较而言HyperScript™ Reverse Transcriptase降低了RNase H活性且大幅度提高了热稳定性。HyperScript™ Reverse Transcriptase可耐受更高的反应温度,适用于具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。
HyperScript™ RT SuperMix for qPCR (with gDNA wiper)适用于两步法qRT-PCR检测,5×SuperMix中含有逆转录所需的所有成分,加入模板RNA和RNase Free ddH2O就可以迅速进行反应。产品中包含的4×gDNA wiper可在逆转录前快速彻底去除体系中潜在的基因组干扰。该试剂盒非常适合于低浓度RNA模板的逆转录反应。5×SuperMix在-20°C不会冻结,使用方便。
本产品针对qPCR进行特别优化,经过比例优化的Oligo (dT)23VN primer mix/Random primers,使cDNA合成可从RNA转录本的各个区域起始并具有相同的逆转录效率,最大程度保证了qPCR结果的真实性和可重复性。逆转录产物适用于SYBR Green和探针法qPCR,可以根据实验目的,选择相应的试剂配合使用,进行高性能的基因表达分析。
5X RT SuperMix中含有逆转录所需的所有成分,方便操作;
经过优化的Oligo (dT)23VN引物与随机引物比例可最大程度保证qPCR结果的真实性和可重复性;
基于高效的HyperScript™ Reverse Transcriptase,适用于具有二级结构的RNA 模板;
可检测低至1 pg的模板起始量;
提供的Oligo (dT)23VN引物比Oligo (dT)18对模板锚定能力更强,逆转录效率更高。
组分 | 50 rxns (20 μL reaction) | 100 rxns (20 μL reaction) |
RNase Free ddH2O | 1 mL | 1 mL x 2 |
4X gDNA wiper mix | 200 μL | 400 μL |
5X RT SuperMix | 200 μL | 400 μL |
5X No RT control Mix | 20 μL | 40 μL |
-20°C保存。 |
1)Q:收到产品后应怎么保存?
A:所有组分-20°C保存,有效期至少1年。
2)Q:能否通过延长逆转录时间来提高逆转录效率?
A:对于大多数基因,延长逆转录时间对逆转录效率并没有明显的提升;但对于一些GC含量较高或含高级复杂结构的模板,延长逆转录时间可提升逆转录效率。
3)Q:可以通过测逆转录产物cDNA的浓度来判定逆转录的效率吗?
A:不可以。因为逆转录产物除了cDNA外,还有buffer、逆转录酶、引物、未转录的模板RNA等,这些都会干扰cDNA浓度测定结果,因此不能反应真实的cDNA产量。
4)Q:逆转录产物用PCR扩增后跑胶检测无特异性条带?
A:可能原因及解决方案如下:
a. 模板RNA发生了降解:哺乳动物细胞或组织的总RNA琼脂糖电泳后应该可以看到清晰的18S和28S rRNA条带,并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例应该大于等于2.0,如果比例小于2.0,则说明总RNA发生了显著的降解,需重新制备模板。
b. 模板RNA的纯度偏低:在提取纯化RNA的过程中,残留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA等会抑制逆转录酶活性。可对RNA样品进行柱纯化,或者进行沉淀、洗涤和再溶解,通常可以有效去除残留的污染物。
c. 逆转录模板量不足:在抽提获得总RNA后,在进行一些精细的定量检测时通常会进行DNase I消化,以充分去除可能的残留的DNA的干扰。DNase I进行热失活时,需要加入EDTA至终浓度为2.5mM,否则RNA在没有螯合剂的情况下,在加热过程中容易被水解,从而导致模板量不足。此外,扩增特定基因时,需要先查询该基因的组织分布特点,利用其高表达的组织进行目的基因的反转录和克隆。
d. RNA模板富含GC或容易形成二级结构:可考虑把反转录温度提高到45-55°C。