客户合作文章基本信息
研究背景
NRAS在多种人类实体瘤中频繁突变，热点突变主要位于谷氨酸61位（Q61R/K/L）。突变NRAS通过持续激活下游MAPK、PI3K/AKT及Ral信号通路，驱动肿瘤增殖、转移，并与患者不良预后密切相关。然而，由于NRAS的GTP结合亲和力极高，且缺乏明确药物口袋，目前尚无直接靶向突变NRAS的抑制剂获批。此外，临床证据表明NRAS突变患者对PD-1单药治疗反应显著降低、生存结局更差，提示其肿瘤微环境存在高度免疫抑制。cGAS-STING通路可通过识别胞质DNA启动I型干扰素反应，但其在NRAS突变肿瘤中的免疫调控机制及治疗潜力尚不清楚。近日，来自中山大学的研究团队发现NRAS突变可抑制cGAS-STING通路，导致免疫逃逸，靶向NRAS通路相关靶点SOS1联合STING激动剂有望成为NRAS突变肿瘤精准治疗的新策略。
研究内容
为了阐明NRAS突变产生的肿瘤免疫抑制微环境的特征，并评估IFNα反应的临床意义，研究人员分析TCGA泛癌数据库中NRAS突变频率，并对皮肤黑色素瘤（SKCM）、甲状腺癌（THCA）及结直肠癌（COADREAD）患者数据进行GSEA分析，同时分析NRAS Q61K突变黑色素瘤小鼠模型（GSE39987）的RNA-seq转录组测序数据，检测IFNα/IFNγ反应通路的富集评分。结果显示，黑色素瘤等肿瘤中NRAS突变频率较高，且三种肿瘤中IFNα和IFNγ反应均显著下调；NRAS突变黑色素瘤小鼠模型中IFN反应同样受抑制；TCGA数据显示NRAS突变黑色素瘤患者IFNα反应低评分与较差的总生存期、疾病特异性生存期及无进展生存期显著相关，且多变量Cox回归分析证实IFNα反应是独立预后因素。综上所述，IFNα反应在NRAS突变肿瘤中显著下调，并与NRAS突变黑色素瘤患者的不良预后密切相关。
为了探究IFN-I反应在NRAS突变肿瘤细胞中的作用并确定突变NRAS影响的具体先天免疫通路，研究人员使用siRNA在多种NRAS突变细胞系（HT1080、ME4405、NCI-H1299、SNU719）中敲低Q61突变NRAS，分别采用随后分别用RIG-I/MAVS通路激动剂poly(I:C)、STING激动剂2'3'-cGAMP（B8362）、cGAS激动剂poly(dA:dT)和TLR4-TRIF通路激动剂LPS刺激细胞，并通过RNA-seq、GSEA、Western blot及qRT-PCR检测下游信号分子，同时使用带有2'-O-甲基修饰的siRNA排除序列非特异性干扰，并在HT1080细胞中过表达NRASQ61K或NRASWT进行验证，检测指标包括IFNB1、CXCL10、ISG15的mRNA水平以及STING、TBK1、IRF3的磷酸化水平。结果显示，敲低突变NRAS后，2'3'-cGAMP和poly(dA:dT)可导致IFNB1和CXCL10表达显著升高。转录组测序证实poly(dA:dT)可导致IFNα反应在敲低组显著正富集。敲低突变NRAS增强了TBK1、IRF3和STING的磷酸化及下游基因表达，且该效应在NRAS野生型细胞中不明显。过表达NRASQ61K可逆转上述效应，而野生型NRAS对此无效。综上所述，NRAS突变肿瘤细胞中的cGAS-STING信号通路受到抑制。
为了探究NRAS突变癌细胞中cGAS-STING通路失活的分子机制，研究人员通过qRT-PCR和Western blot检测cGAS和STING的表达，通过cGAMP ELISA检测cGAMP生成量，通过免疫荧光观察STING的亚细胞定位和IRF3的核质分布，通过CO-IP检测STING与TBK1/IRF3的结合，并使用AKT抑制剂MK-2206处理细胞并检测TBK1和IRF3的磷酸化水平。结果显示，敲低突变NRAS不影响cGAS和STING的表达及cGAMP生成，也不影响STING向高尔基体的转运，但显著增强了STING与TBK1和IRF3的结合。IRF3在NRAS突变细胞中滞留于胞质，敲低后转入细胞核。NRAS突变细胞中AKT过度激活，抑制AKT后可恢复TBK1和IRF3的磷酸化。综上所述，NRAS突变癌细胞中STING/TBK1/IRF3三聚体复合物的形成受阻，从而抑制IRF3的核转位和转录活性，其机制与AKT过度激活有关。
为了研究突变NRAS对cGAS-STING通路介导的细胞死亡的影响，研究人员利用CRISPR-Cas9技术在HT1080和NCI-H1299等细胞中构建STING敲除和IRF3敲除细胞系，在敲低突变NRAS后用cGAS-STING通路的激动剂HT-DNA或poly(dA:dT)刺激细胞，通过qRT-PCR检测IFNB1、CXCL10和ISG15的mRNA水平，通过PI染色流式细胞术检测细胞死亡率，并通过Western blot检测STAT1的磷酸化水平。结果显示，敲低突变NRAS后，HT-DNA和poly(dA:dT)刺激显著上调IFNB1、CXCL10和ISG15的表达，增加细胞死亡率，增强STAT1磷酸化。而敲除 STING或IRF3后，以上效应消失或减弱。综上所述，NRAS突变细胞无法有效启动cGAS-STING信号激活所诱导的内在细胞死亡反应。
为了验证cGAS-STING信号失活是否介导NRAS突变肿瘤的免疫逃逸，研究人员在体外将poly(dA:dT)或HT-DNA预处理的NRAS突变肿瘤细胞与未成熟树突状细胞（DC）或PBMC共培养，流式检测DC成熟标志物（CD86、MHC II）和肿瘤细胞死亡率；同时建立Dox诱导型NRASQ61R过表达小鼠肿瘤模型，使用STING激动剂SR-717和Dox处理，检测肿瘤生长、肿瘤浸润淋巴细胞及免疫荧光检测肿瘤组织中磷酸化IRF3（pIRF3）等IFN-I反应相关指标的表达。结果显示，敲低NRAS显著促进DC成熟和PBMC介导的肿瘤细胞杀伤，而STING敲除可阻断这些效应。NRASQ61R过表达抑制了SR-717诱导的TBK1激活和ISG表达，削弱了SR-717的抑瘤效果，并阻止了SR-717对CD8+ T细胞、NK细胞浸润及细胞毒性功能的增强作用。SR-717仅可在非Dox组（NRAS野生型）中显著增加pIRF3阳性肿瘤细胞比例。综上所述，NRAS突变肿瘤中cGAS-STING通路失活可抑制IFN-I反应，介导肿瘤免疫逃逸。
为了筛选能够重新激活NRAS突变肿瘤细胞cGAS-STING通路的药物，研究人员用8种涉及RAS相关通路不同靶点的激酶抑制剂处理HT1080（NRAS突变）和A375（NRAS野生型）细胞，通过ELISA检测条件培养基中CXCL10的分泌水平。结果显示，SOS1抑制剂BAY-293在HT1080细胞中最显著地促进CXCL10释放，但对A375细胞无影响。因此，研究人员进一步使用三种SOS1抑制剂（BAY-293、BI-3406、MRTX0902）处理多种NRAS突变和野生型细胞，通过Western blot检测TBK1和IRF3的磷酸化，通过qRT-PCR检测IFNB1和CXCL10的mRNA表达。结果显示，三种SOS1抑制剂可增加NRAS突变细胞中TBK1和IRF3的磷酸化以及IFNB1、CXCL10的mRNA表达，但在NRAS野生型细胞中无明显作用。综上所述，靶向SOS1的抑制剂可重新激活NRAS突变肿瘤细胞中的cGAS-STING信号通路。
为了验证SOS1抑制剂联合STING激动剂对NRAS突变肿瘤的治疗潜力及特异性，研究人员在体外用SOS1抑制剂（BAY-293、BI-3406）和STING激动剂SR-717单独或联合处理Dox诱导型NRASQ61R过表达细胞，与OT-1 T细胞共培养后流式检测肿瘤细胞死亡率；随后建立上述小鼠模型，给予Dox、SR-717和BI-3406处理，观察肿瘤生长、小鼠体重，流式分析肿瘤浸润NK和CD8+ T细胞及IFNγ、颗粒酶B表达，免疫荧光检测pIRF3，同时在无Dox的NRAS野生型肿瘤中验证联合效应。结果显示，体外联合治疗显著增强OT-1 T细胞介导的肿瘤杀伤；体内联合治疗显著抑制NRASQ61R肿瘤生长，优于单药治疗，且未引起明显毒性。联合治疗显著增加肿瘤浸润NK和CD8+ T细胞比例及其IFNγ和颗粒酶B的表达，并提高pIRF3阳性肿瘤细胞比例。但在NRAS野生型肿瘤中，BI-3406无显著抗肿瘤作用，联合治疗未显示协同效应。综上所述，SOS1抑制剂与STING激动剂联合可通过激活cGAS-STING信号增强抗肿瘤免疫，特异性地抑制NRAS突变肿瘤生长。
研究结论
本研究系统揭示了NRAS突变肿瘤中存在cGAS-STING先天免疫信号通路的系统性抑制，导致I型干扰素反应下调和免疫逃逸。突变NRAS通过激活下游AKT信号，阻断STING/TBK1/IRF3三聚体复合物的组装，抑制IRF3核转位及下游基因转录。SOS1抑制剂能够特异性地重新激活NRAS突变肿瘤细胞中的cGAS-STING信号，而SOS1抑制剂与STING激动剂联合应用在体内外均可协同增强抗肿瘤免疫应答，促进细胞毒性NK细胞和CD8+ T细胞的浸润与活化，显著抑制NRAS突变肿瘤的生长，且该联合策略对NRAS野生型肿瘤无明显协同效应。因此，靶向SOS1联合STING激动剂为NRAS突变肿瘤提供了一种有前景的精准治疗新策略。
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