客户合作文章基本信息
标题
Nociceptor neurons promote PDAC progression and cancer pain by interaction with cancer-associated fibroblasts and suppression of natural killer cells
期刊 Cell Research
IF值 31.1
DOI 10.1038/s41422-025-01098-4
客户单位
天津医科大学、美国杜克大学
引用产品
APExBIO为本研究提供了Rimegepant（BMS-927711，A3259），用于体内特异性阻断CGRP信号通路，证实伤害感受器神经元分泌的CGRP抑制NK细胞，驱动PDAC进展与癌痛。
研究背景
胰腺导管腺癌（PDAC）以神经周围浸润为特征，且癌痛是其最常见且最严重的症状之一。既往研究虽揭示了交感和副交感神经在PDAC进展中的作用，但感觉神经在PDAC肿瘤微环境中的免疫调节功能及其机制尚不明确。已有研究表明，伤害感受器神经元在黑色素瘤等模型中可抑制抗肿瘤免疫，但其在PDAC中对免疫监视的影响亟待深入探究。近日，来自天津医科大学和美国杜克大学的研究团队解析了伤害感受器神经元在PDAC进展和癌痛中的作用及其潜在机制，为开发新的治疗策略提供依据。
研究内容
为了探究伤害性神经支配在PDAC发展中的作用，研究人员首先通过免疫荧光染色检测了人PDAC组织与正常胰腺组织中CGRP+伤害感受神经的分布，并使用TRPV1激动剂RTX清除C57BL/6小鼠的TRPV1+伤害感受器神经元，随后建立原位PDAC模型，利用活体生物发光成像、肿瘤称重和生存分析等方法评估肿瘤进展。结果显示，人PDAC组织和小鼠PDAC肿瘤中的CGRP+神经支配均显著增加；经RTX处理后，小鼠在热板试验中表现出热痛觉迟钝，证实伤害感受器被有效清除；与对照组相比，RTX处理组小鼠的肿瘤生物发光信号显著减弱、肿瘤重量明显降低，且总体生存时间显著延长，而该处理并未影响IB4+、ChAT+或TH+等其他类型神经纤维。综上所述，清除TRPV1+伤害感受器神经元能够有效抑制PDAC的进展并改善预后。
为了验证伤害感受器神经元清除是否能够缓解PDAC相关的癌痛并改善运动功能，研究人员在荷瘤小鼠上进行了机械痛觉过敏测试、CPA试验以及旷场试验等行为学实验。结果显示，与对照组相比，RTX处理组小鼠在肿瘤接种后第3、5、7周的腹部机械刺激反应频率显著降低，表明机械性痛觉过敏明显减轻；在CPA试验中，RTX组小鼠因低强度机械刺激引起的自发性疼痛显著缓解；旷场试验进一步显示，RTX组小鼠在肿瘤接种7周后的总运动距离和平均速度均显著增加。综上所述，清除TRPV1+伤害感受器神经元能够显著缓解PDAC小鼠的癌症诱导性内脏疼痛，并有效改善其运动功能和生活质量。
为了探究伤害感受器神经元清除抑制PDAC进展的免疫学机制，研究人员对RTX处理与对照组的PDAC肿瘤组织进行了单细胞转录组测序，并通过流式细胞术系统检测了肿瘤浸润的NK细胞、T细胞、MDSCs及巨噬细胞等群体及其功能状态。结果显示，单细胞转录组测序分析表明RTX处理后肿瘤微环境中NK细胞的比例显著增加，而T细胞比例无显著变化；NK细胞的活化标志物（TNF-α、IFN-γ、Granzyme B）转录水平显著上调。流式细胞术进一步证实，RTX组肿瘤中NK细胞（CD3–NK1.1+）的比例和数量均显著增加，而CD4+ T细胞、CD8+ T细胞的比例未发生显著变化；同时，NK细胞中TNF-α和Granzyme B（GrzmB）的表达水平显著升高，T细胞耗竭标志物TIM-3和PD-1则有所降低，但外周免疫器官中未见类似变化。综上所述，伤害感清除受器神经元能够特异性地改善PDAC肿瘤微环境中NK细胞的浸润数量与细胞毒功能，同时降低T细胞的耗竭程度。
为了通过遗传学和选择性清除策略进一步验证伤害感受器神经元经NK细胞调节抑制PDAC的作用，研究人员构建TRPV1+神经元表面特异性表达白喉毒素受体DTR的Trpv1-DTR小鼠，注射白喉毒素（DTX）清除小鼠全身的TRPV1+神经元；对C57BL/6小鼠进行鞘内注射RTX，选择性清除胸段背根神经节（DRG）的TRPV1+神经元，随后检测肿瘤生长与NK细胞功能。结果显示，DTX处理的Trpv1-DTR小鼠在肿瘤接种后第5周和第7周均表现出局部肿瘤负荷和肿瘤重量显著降低，同时肿瘤微环境中NK细胞浸润数量及其活化标志物（TNF-α、GrzmB）表达显著增强；同样，鞘内注射 RTX 也显著降低了肿瘤负荷和重量，并伴随NK细胞浸润与活化的增强。综上所述，清除全身或DRG的伤害感受器神经元，均能激活NK细胞功能，进而有效抑制PDAC生长。
为了明确NK细胞与T细胞在清除伤害感受器引起的抗肿瘤效应中的相对贡献，研究人员在RTX处理的基础上，通过给小鼠持续腹腔注射anti-NK1.1抗体耗竭NK细胞，并在T细胞缺陷的Rag1–/–小鼠中重复实验，结合活体成像、肿瘤称重和流式细胞术评估肿瘤进展。结果显示，在NK细胞耗竭后，RTX处理原本带来的肿瘤负荷降低和肿瘤重量减轻效应完全消失；而在缺乏成熟T细胞和B细胞的Rag1–/–小鼠中，RTX处理依然能够显著抑制肿瘤生长，并显著增强肿瘤组织中NK细胞的浸润数量及其TNF-α、GrzmB的表达水平。综上所述，介导伤害感受器神经元清除抑制PDAC进展的关键效应细胞是NK细胞，而非T细胞。
CGRP（降钙素基因相关肽）是伤害感受器神经元在外周受到有害刺激时从神经末梢释放的主要神经肽之一。前期研究提示，CGRP可能通过免疫调节功能影响肿瘤进展。为了探究伤害感受器神经元释放的CGRP是否介导其对NK细胞的调节作用，研究人员通过单细胞转录组测序和Western blot检测了PDAC组织中CGRP受体RAMP1、CALCRL与P物质受体（NK-1R）的表达差异，利用ELISA检测了患者及小鼠组织中CGRP水平，并使用口服CGRP受体拮抗剂Rimegepant （A3259）处理PDAC小鼠，同时建立了Calca–/–（CGRP全局敲除）小鼠模型。结果显示，PDAC组织中RAMP1和CALCRL的表达远高于NK-1R。PDAC患者和小鼠的胰腺/肿瘤组织及血清中CGRP水平显著升高，而RTX处理后降低。Rimegepant治疗显著降低了肿瘤负荷、提高了生存率，同时增加了NK细胞浸润并增强其TNF-α和GrzmB表达，且能有效缓解机械性痛觉过敏和自发性疼痛、改善运动功能。Calca–/–小鼠同样表现出肿瘤减小和NK细胞功能增强。综上所述，伤害感受器神经元通过释放CGRP调节NK细胞功能，进而促进PDAC进展和癌痛，阻断CGRP信号具有抗肿瘤和镇痛双重效应。
为了筛选并验证介导CGRP调控NK细胞功能的关键细胞因子，研究人员对单细胞转录组测序数据和RT-PCR结果进行了NK细胞相关细胞因子与趋化因子的综合分析。结果显示，RTX处理后肿瘤组织中IL-2、IL-12及IL-15的转录水平显著升高；GO富集分析也表明RTX组IL-15产生通路上调。已有文献表明，IL-15通可过IL-15/IL-15Rα轴维持NK细胞的活化状态。研究人员通过ELISA检测了肿瘤组织中IL-15等因子的蛋白水平，随后利用anti-IL-15中和抗体阻断IL-15信号通路，观察其对RTX抗肿瘤效应的影响。结果显示，IL-15的蛋白水平经ELISA验证显著增加。当使用anti-IL-15抗体处理后，RTX原本降低肿瘤负荷和肿瘤重量的效应被完全抵消，且RTX诱导的NK细胞浸润增加以及TNF-α、GrzmB表达上调均被显著逆转。综上所述，IL-15是介导伤害感受器神经元/CGRP信号调控NK细胞浸润与细胞毒功能的关键下游因子。
为了明确CGRP调控肿瘤微环境中哪些细胞的IL-15表达及调控机制，研究人员通过单细胞转录组测序分析肿瘤微环境中CGRP受体的表达分布，并结合RT-PCR、Western blot及免疫荧光染色进行验证。结果显示，CGRP受体RAMP1与CALCRL在α-SMA+ CAF亚群和胰腺星状细胞（PSC）中高表达，且免疫荧光证实RAMP1/CALCRL与α-SMA存在共定位。 随后，研究人员用CGRP处理小鼠及人PSC，将DRG神经元与PSC共培养，通过ELISA检测上清IL-15水平。结果显示，CGRP处理或与野生型DRG神经元共培养可显著降低PSC的IL-15分泌，使用Rimegepant或敲除RAMP1可逆转CGRP引发的IL-15下调。培养过经CGRP处理的野生型PSC的培养基可显著抑制NK细胞增殖及TNF-α、GrzmB表达，而培养过RAMP1敲除PSC的培养基丧失该抑制作用，且CGRP对NK细胞无直接作用。综上所述，伤害感受器神经元释放的CGRP通过结合并激活CAF表面的RAMP1受体，抑制CAF的IL-15分泌，进而削弱NK细胞的肿瘤浸润与细胞杀伤能力。
为了揭示CAFs与伤害感受器神经元之间的双向通讯机制，研究人员通过单细胞转录组测序分析NGF在肿瘤微环境中的细胞来源，利用ELISA检测共培养体系中NGF和CGRP的水平变化，并通过TRKA抑制剂、NGF敲除以及神经突起生长实验验证NGF的功能。结果显示，NGF主要在CAF中表达。DRG神经元与PSC共培养或CGRP直接刺激均可促进PSC释放NGF，而Rimegepant处理或Ramp1敲除则削弱该效应。NGF可促进DRG神经元产生CGRP。PSC与DRG神经元共培养后CGRP水平升高，使用TRKA抑制剂或敲除NGF均可逆转这一现象。培养过PSC的培养基能显著促进DRG神经元的神经突起生长，而培养过NGF敲除PSC的培养基则丧失该能力。NGF对NK细胞的增殖和活化无直接影响。综上所述，CAF通过分泌NGF促进伤害感受器神经元产生CGRP，形成NGF-CGRP正反馈环路，共同促进PDAC进展。
为了验证临床中伤害感受器神经支配与PDAC患者预后及癌痛的关联，研究人员对175例PDAC患者肿瘤组织进行了多重荧光免疫组化染色，检测α-SMA、RAMP1、CGRP、IL-15、NCR1，对43例新鲜肿瘤组织进行流式细胞术检测NK细胞浸润，并结合数字评分法（NRS）评估疼痛强度，通过Kaplan-Meier法和Cox回归分析进行生存预后评估。结果显示，CGRP高表达的患者肿瘤中NK细胞浸润显著减少，IL-15荧光信号减弱；CGRP表达水平与NK细胞数量呈显著负相关；CGRP高表达患者的NRS疼痛评分显著高于低表达组；Kaplan-Meier分析显示高CGRP组患者的总生存期（OS）和无复发生存期（RFS）均显著缩短；多变量Cox回归分析进一步证实，CGRP+伤害感受神经支配是PDAC患者OS和RFS的独立不良预后因素。综上所述，PDAC肿瘤微环境中伤害感受神经支配与NK细胞浸润呈负相关、与癌痛强度呈正相关，并可作为预测患者术后生存的独立预后指标。
研究结论
本研究系统阐明了PDAC肿瘤微环境中伤害感受器神经元、CAF与NK细胞之间的神经-免疫-基质交互网络：CAF通过分泌NGF促进伤害感受器神经元释放CGRP，CGRP反过来作用于CAF上的RAMP1受体，抑制其IL-15的分泌，从而削弱NK细胞的肿瘤浸润与细胞毒功能，最终促进PDAC进展并加剧癌痛。临床数据进一步证实，肿瘤组织中CGRP+伤害感受神经支配水平与患者NK细胞浸润呈负相关，与疼痛强度及不良预后呈正相关。因此，靶向伤害感受器神经元或其释放的CGRP信号有望成为同时抑制PDAC进展和缓解癌痛的新型治疗策略。
沪公网安备 31011002003500