在往期公众号中（点击查看），我们已经系统介绍过细胞焦亡的定义、核心机制与生理病理功能，并提到脂多糖（LPS）联合尼日利亚菌素（Nigericin）是诱导经典NLRP3炎性小体介导焦亡的常用方案。
本期我们将深入实验层面，详细拆解LPS与Nigericin协同触发焦亡的分子原理，分享标准化的诱导操作流程与关键注意事项，同时完整讲解基于乳酸脱氢酶（LDH）释放的焦亡定量检测体系，为大家的实验实操提供可参考的具体方案。
实验原理
LPS与Nigericin分别承担启动信号与激活信号的功能，协同完成炎性小体组装活化：
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启动阶段：脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的主要致病成分，可通过细胞膜表面的TLR4激活下游NF-κB信号通路，在转录水平上调NLRP3受体、pro-IL-1β、pro-IL-18等炎性小体核心组分与效应分子的表达。
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激活阶段：Nigericin是一种选择性K+离子载体，可嵌入细胞膜并介导胞内钾离子快速外流，降低胞内K+浓度，导致NLRP3受体发生构象改变，通过PYD结构域募集衔接蛋白ASC。ASC进一步通过CARD结构域招募pro-Caspase-1，最终组装为炎性小体复合物，进入焦亡执行。
注意事项
材料与试剂
细胞系：小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMM）。
主要试剂
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焦亡诱导 |
焦亡检测 |
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仪器与耗材
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焦亡诱导 |
焦亡检测 |
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细胞焦亡诱导
溶液准备
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溶液 |
配制方法 |
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无抗生素的DMEM完全培养基 |
无酚红DMEM基础培养基，5%FBS、5 mM HEPES、0.2 mg/mL L-谷氨酰胺、0.05 mM 2-巯基乙醇。 |
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LPS储存液 |
1 mg/mL LPS，0.5% triethylamine，溶于无菌水 |
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Nigericin储存液 |
5 mM Nigericin sodium salt，溶于100%乙醇 |
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LPS工作液 |
用无抗生素的DMEM完全培养基稀释LPS储存液，一般推荐浓度为100 ng/mL LPS |
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Nigericin工作液 |
用LPS工作液稀释Nigericin储存液，一般推荐浓度为，10 μM Nigericin sodium salt。 |
细胞准备
①
将小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMM）与含30% L929培养上清的DMEM培养7天进行分化，并在无抗生素条件下维持。
②
将分化成熟的BMM以2×104个细胞/100 μL的密度接种于培养板，每孔需要100 μL无抗生素的DMEM完全培养基。
③
200 g离心5分钟，确保细胞均匀分布于孔底，避免边缘堆积。
④
将培养板置于37°C、5% CO2培养箱中过夜，使细胞充分贴壁。
LPS处理
①
次日，去除旧培养液基，加入50 μL新鲜预热的LPS工作液。
②
将板放回37°C、5% CO2培养箱孵育3–4小时。
Nigericin处理
①
LPS处理结束后，向各孔中加入50 μL Nigericin工作液（Nigericin最终浓度为工作液浓度的1/2），使最终体系体积为100 μL。
②
将板放回37°C、5% CO2培养箱继续孵育1小时，即可进行后续的焦亡指标检测。
细胞焦亡检测（LDH检测）
细胞焦亡的评估可从形态学、分子标志物与生化指标多个维度开展。形态学评估通常借助普通光学显微镜实现，具体可以参考我们之前的公众号（点击查看）。若需量化焦亡发生程度，需结合免疫印迹检测GSDMD剪切、ELISA检测成熟IL-1β释放、比色法检测胞质酶释放等手段。
其中，基于INT底物比色法的乳酸脱氢酶（LDH）释放检测因操作简便、检测通量高、结果稳定且无需特殊抗体，是实验室中评价焦亡水平最常用的初筛与定量方法。
实验原理
LDH是一类广泛存在于所有有核细胞胞质中的稳定氧化还原酶，在细胞膜结构完整时无法透过脂质双分子层，仅在细胞膜发生不可逆损伤时才会释放至胞外培养基中。
在焦亡过程中，GSDMD蛋白N端结构域在细胞膜上形成的亲水性孔道会直接破坏细胞膜屏障功能，导致胞内LDH快速释放至培养上清，因此上清中LDH活性可直接反映焦亡诱导的膜损伤程度。
本检测方法依托两步级联酶促反应实现：
▷
第一步，上清中释放的LDH催化底物L-乳酸发生氧化反应生成丙酮酸，同时将NAD+还原为NADH。
▷
第二步，在电子传递介质MPMS的介导下，NADH携带的氢被传递至INT，将无色的INT还原为水溶性的红色甲臜（Formazan）产物。
该红色产物在490 nm波长处具有特征吸收峰，其吸光度值与上清中LDH活性、细胞焦亡程度呈线性正相关，通过酶标仪定量检测吸光度即可计算细胞焦亡比例。
由于焦亡本身伴随细胞膜自发性破裂，除用于标定细胞最大LDH释放量的裂解对照孔需额外加入裂解剂处理外，其余实验组与对照组样本均无需额外裂解操作，直接取培养上清检测即可。
LDH检测原理
（DOI: 10.1007/978-1-62703-523-1_7）
试剂配制
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溶液 |
配制方法 |
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Tris-HCl |
0.2 M，pH=8.2 |
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乳酸/NAD工作液 |
6.4 mM NAD, 320 mM L-乳酸，溶于0.2 M Tris-HCl，pH=8.2 |
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INT工作液 |
4 mM INT，溶于0.2 M Tris-HCl，pH=8.2 |
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MPMS工作液 |
150 mM MPMS，溶于0.2 M Tris-HCl，pH=8.2 |
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乙酸 |
1M |
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细胞裂解液 |
9% Triton-X100，水溶液 |
检测工作液配制
每5 mL检测工作液包含：2.5 mL INT工作液，2.5 mL 乳酸/NAD工作液，0.5 μL MPMS工作液。溶液应呈淡粉色。
检测流程
①
Nigericin处理结束后，离心96孔板（4°C，500 g，5 min），使细胞碎片沉淀至孔底。
②
裂解对照处理：向裂解对照孔加入裂解液。每100 μL样本加10 μL细胞裂解液，混匀裂解3分钟。
③
取50 μL上清液，转移至新的不透明96孔检测板中。
④
向检测板每孔加入50 μL检测工作液，将板置于摇床上轻微震荡混匀（300–500 rpm，15 sec）。
⑤
室温避光孵育60 min。
⑥
每孔加入50 μL 1 M乙酸终止反应，再次震荡混匀（300–500 rpm，15 sec），以稳定显色产物。
⑦
使用酶标仪在490 nm波长下测定各孔OD值。
数据分析
使用以下公式计算LDH释放百分比，判断焦亡的程度：
Sample：实验组上清的吸光度。
Untreated Sample：阴性对照上清的吸光度。
Media：仅含培养基的背景吸光度。
Lysis：裂解对照的吸光度。
Lysis Media：裂解对照+培养基的背景吸光度。
常见问题
细胞没有发生焦亡
细胞本身GSDM、NLRP3、Caspase或其它上下游基因表达水平受到抑制，需要增加诱导剂的用量和孵育时间。仍然无效可以考虑更换文献中常见的细胞系。
LDH信号低或无信号
细胞密度过低，需提高接种密度。
实验体系含有丙酮酸钠或其它LDH抑制剂，需要换不含丙酮酸钠的培养基，检查待测化合物是否干扰酶活。
孵育时间不足，进行动力学实验优化孵育时间。动力学实验期间不使用乙酸终止反应。
LDH整体信号过强
细胞浓度过高，需优化接种密度。
细胞孵育过久，需缩短孵育时间。
减少MPMS用量。
LDH终止后染料变黄
乙酸过量导致pH < 4.0，甲臜自发氧化，需减少乙酸用量。
参考文献：
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den Hartigh AB, Fink SL. Pyroptosis Induction and Detection. Curr Protoc Immunol. 2018 Aug;122(1):e52. doi: 10.1002/cpim.52. Epub 2018 Jul 20. PMID: 30028908; PMCID: PMC6339837. -
Kaja S, Payne AJ, Naumchuk Y, Koulen P. Quantification of Lactate Dehydrogenase for Cell Viability Testing Using Cell Lines and Primary Cultured Astrocytes. Curr Protoc Toxicol. 2017 May 2;72:2.26.1-2.26.10. doi: 10.1002/cptx.21. PMID: 28463416; PMCID: PMC5501254. -
Rayamajhi M, Zhang Y, Miao EA. Detection of pyroptosis by measuring released lactate dehydrogenase activity. Methods Mol Biol. 2013;1040:85-90. doi: 10.1007/978-1-62703-523-1_7. PMID: 23852598; PMCID: PMC3756820.
客户研究案例 Cell Research（IF=25.9）
标题 Mannose antagonizes GSDME-mediated pyroptosis through AMPK activated by metabolite GlcNAc-6P
期刊 Cell Research
客户单位 厦门大学
Nigericin sodium salt的作用 Nigericin sodium salt与LPS联合用于构建GSDMD依赖性的经典焦亡模型，验证甘露糖对焦亡的抑制仅作用于GSDME介导的焦亡，对GSDMD介导的焦亡无阻断效果。
检测方法
形态学观察，LDH检测
样本
PMA（50 nM）处理的36 h后的THP-1细胞
焦亡诱导
步骤
LPS处理
Nigericin处理
终浓度
100 ng/ml
10 μM
孵育时间
4 h
2 h
研究简介
GSDME介导的细胞焦亡是铂类化疗引发胃肠损伤、肾毒性的核心机制，但该途径的负调控通路尚不明确。
研究在GSDME焦亡细胞模型中筛选多种己糖，证实仅甘露糖可特异性抑制GSDME介导的焦亡，对GSDMD、GSDMC介导的焦亡无作用。通过CRISPR敲除代谢支路关键酶并结合通路抑制剂，锁定己糖胺合成途径产物GlcNAc-6P为关键效应分子。经AMPK抑制剂、基因敲除及激活剂正反验证，确认AMPK是甘露糖抑制焦亡的必需因子。结合同位素示踪、ITC与生化实验，证实GlcNAc-6P结合激活AMPKα，活化的AMPK直接磷酸化GSDME的Thr6位点，改变其构象以抑制Caspase-3切割。在细胞、类器官、基因编辑小鼠、肿瘤模型及化疗患者中验证，敲除AMPK或GSDMET6A突变可消除甘露糖保护效应，甘露糖可减轻化疗组织损伤。
综上所述，甘露糖经己糖胺生物合成途径代谢生成GlcNAc-6P，后者直接结合AMPK α亚基并促进LKB1介导的AMPK活化。激活的AMPK磷酸化GSDME的Thr6位点，阻断Caspase-3对GSDME的切割，抑制GSDME介导的焦亡。因此，甘露糖可在不削弱化疗抗肿瘤效果的前提下减轻正常组织毒副作用。
引用产品 Nigericin sodium salt（尼日利亚菌素钠盐，B7644）、DON（6-Diazo-5-oxo-L-norleucine，C3575）、Z-VAD-FMK（A1902）、Dorsomorphin（B3252）、Protease inhibitor cocktail（K1007）、Phosphatase inhibitor cocktail（K1015）
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产品上新
上新！APExBIO高品质LPS正式上架
下图LPS诱导RAW264.7细胞产生炎症介质NO的对比实验由APExBIO实验员亲自验证。数据显示，在0.0001~10 μg/ml的浓度范围内，APExBIO的LPS均优于同类竞品，同等浓度下具备更强的生物活性与刺激效价。
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