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细胞染色实战（第二弹）：Amplex red过氧化氢与过氧化物酶活性检测

2026-06-10 17:08:26

Amplex Red是检测过氧化氢（H₂O₂）的荧光探针，也可以间接测定过氧化物酶活性。从实验室里的细胞氧化应激和代谢研究，到医院的临床诊断，再到野外的环境样本分析，到处都能看到它的身影。

今天我们整理了一份超全的Amplex Red检测指南，给大家详细拆解不同检测体系的试剂配比、样本处理要求与仪器参数设置。

实验原理

Amplex red是一种高灵敏度的荧光探针，常用于检测过氧化氢（H₂O₂）含量或过氧化物酶活性。在辣根过氧化物酶（HRP）的催化作用下，Amplex red与过氧化氢反应生成粉色的试卤灵（Resorufin），产生红色强荧光信号。Amplex red适用于细胞生物学、分子生物学、临床诊断、环境科学等领域中的氧化应激、酶活性分析等研究。

Amplex red与H₂O₂反应原理

（DOI: 10.2478/s11535-008-0021-x）

注意事项

①

储存条件：

►

Amplex red试剂需避光保存，检测过程中所有操作必须严格避光。

►

Amplex red可以溶于DMSO，配制成10 mM储存液，避光保存于-80℃。储存液需分装保存，避免反复冻融导致降解，保存时间为3-5天。

►

Amplex red对空气敏感，工作液建议现配现用，若需保存，应在4℃避光条件下保存不超过24小时。

②

巯基化合物（如DTT、2-巯基乙醇）会影响Amplex red的稳定性，因此，反应体系中DTT或2-巯基乙醇的终浓度不得超过10 μM。

③

Amplex red在pH>8.5条件下不稳定。此外，在pH<6.0时，反应产物试卤灵吸收最大值移至480 nm，且荧光量子产率显著降低。因此，所有反应需在pH 7-8范围内进行。

④

每次实验建议设置以下对照：

►

阳性对照：如果不设置标准曲线，则需要设置阳性对照，如10 μM H₂O₂，2 mU/mL HRP。

►

阴性对照：仅检测缓冲液或KRPG。

►

空白对照（可选）：不加入Amplex red工作液的样本。

⑤

样本处理：

►

样本处理后需要立即检测，避免H₂O₂降解。

►

含抗坏血酸等高还原性成分的样本会导致H₂O₂还原分解导致干扰，需要用抗坏血酸氧化酶等试剂进行预处理。

►

Amplex red有刺激性，需要戴手套操作。

试剂与器材

主要试剂

试剂名称	备注
Amplex red	溶于DMSO，配制成10 mM储存液
HRP	-
H₂O₂	推荐3% H₂O₂
Tris	用于配制检测缓冲液
CaCl₂	用于配制检测缓冲液
KCl	仅活细胞样本
MgSO₄	仅活细胞样本
葡萄糖	仅活细胞样本
RIPA裂解液	裂解的细胞样本
蛋白酶抑制剂	裂解的细胞样本、组织样本

实验器材

►

酶标仪

►

离心机

►

移液器

►

96孔板或其他多孔板

实验步骤

试剂准备

检测缓冲液

50 mM Tris/5 mM CaCl₂溶液，pH 7.4

Krebs-Ringer 磷酸盐缓冲液（KRPG）

145 mM NaCl、5.7 mM磷酸钠、4.86 mM KCl、0.54 mM CaCl₂、1.22 mM MgSO₄、5.5 mM葡萄糖，pH 7.35。

储存液

溶液	试剂	溶剂	浓度
Amplex red储存液	Amplex red	DMSO	10 mM
HRP储存液	HRP	检测缓冲液	10 U/mL
H₂O₂储存液	H₂O₂	检测缓冲液	20 mM

Amplex red检测工作液

根据实验需求配制Amplex red检测工作液：

组分	Amplex red/HRP检测工作液		Amplex red/H₂O₂检测工作液
组分	H₂O₂检测	活细胞H₂O₂检测	过氧化物酶活性检测
Amplex red	100 μM	50 μM	100 μM
HRP	0.2 U/mL	0.1 U/mL	0

以5 ml为例，需要：

组分	H₂O₂检测	活细胞H₂O₂检测	过氧化物酶活性检测
Amplex red储存液	50 μL	25 μL	50 μL
HRP储存液	100 μL	50 μL	0
H₂O₂储存液	0	0	500 μL
检测缓冲液	4.85 mL	0	4.45 mL
KRPG	0	4.925 mL	0

标准曲线设置

标准曲线用于绝对绝对定量分析，没有标准曲线无法进行绝对定量分析。

H₂O₂检测	活细胞H₂O₂检测	过氧化物酶活性检测
用检测缓冲液稀释将H₂O₂储存液进行12次1:3梯度稀释。务必包含无H₂O₂的空白对照。	无需设置标准曲线。	HRP活性检测：用检测缓冲液稀释将稀释HRP储存液进行12次1:3梯度稀释。务必包含无HRP的空白对照。
用检测缓冲液稀释将H₂O₂储存液进行12次1:3梯度稀释。务必包含无H₂O₂的空白对照。	无需设置标准曲线。	过氧化物酶活性检测：使用对应的过氧化物酶设置标准曲线。需要经过纯化且活性已测定的过氧化物酶。如果没有则可以不设置标准曲线。

样本处理

酶和底物的作用时间一般为30分钟左右，具体实验需要优化条件。

样本类型	适用检测	处理步骤
裂解细胞样本	过氧化物酶活性检测	收集细胞，用PBS洗涤后离心。
		加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解，离心取上清。
组织样本	过氧化物酶活性检测	称取组织，加入预冷的PBS（含蛋白酶抑制剂），冰上匀浆。
		离心取上清。
培养基	-	离心收1000 g，5分钟，取上清。
血清/血浆样本	H₂O₂检测	按照常规的血清/血浆样本处理流程进行处理。处理后无需离心。
细菌样本	H₂O₂检测、过氧化物酶活性检测	离心收集细菌，PBS洗涤后重悬。
		超声破碎或裂解液处理，离心取上清。
活细胞样本	活细胞H₂O₂检测	贴壁细胞：用胰蛋白酶消化，收集细胞悬液。离心收集细胞(1000 g，5分钟)，弃上清。
		悬浮细胞：离心收集细胞(1000 g，5分钟)，弃上清。
		用KRPG缓冲液洗涤细胞3次，每次离心1000 g，5分钟。
生化样本	H₂O₂检测、过氧化物酶活性检测	过氧化物酶活性检测：将待测的酶溶于检测缓冲液中。
		H₂O₂检测：检测前需要提前启动H₂O₂生成反应。该反应条件需要根据相关文献进行优化。根据对应的反应将底物和酶依次溶于检测缓冲液中，置于37℃非CO₂培养箱中孵育。
环境样本	过氧化物酶活性检测	加入检测缓冲液混匀。必要时研磨或离心。

注意事项：

细胞裂解液中存在的内源性蛋白酶会降解HRP，干扰检测结果，样本处理必须配合蛋白酶抑制剂。

内源性过氧化物酶和抗氧化剂会消耗反应所需的过氧化氢，与HRP竞争底物，因此细胞裂解液、组织样本、细菌样本、环境样本不推荐做H₂O₂检测，但是可以做过氧化物酶活性检测。

不建议使用Amplex red检测冻存的细胞培养上清中的过氧化氢（H₂O₂）。因为过氧化氢会随时间降解，且在稀释溶液或含有金属离子、天然抗氧化剂的溶液中降解速度更快。

检测步骤

仪器参数设置

荧光值检测	吸光度法检测
按照以下参数设置酶标仪：	设置检测波长～560 nm。
激发波长530-560 nm，
发射波长～590 nm。

样本准备

步骤	H₂O₂检测	活细胞H₂O₂检测	过氧化物酶活性检测
1	加入样本。以96孔板为例，每孔需加入50 μL样本（包括标准曲线样本）	加入Amplex red/HRP工作液，离心。以96孔板为例，每孔需加入100 μL Amplex red/HRP工作液。将反应混合液37℃预热10分钟。	加入含有过氧化物酶样本。以96孔板为例，每孔需加入50 μL样本（包括标曲样本）
2	加入等体积的Amplex red/HRP工作液，混匀。以96孔板为例，每孔需加入50 μL Amplex red/HRP工作液。	加入悬浮于KRPG缓冲液的细胞，体积为Amplex red/HRP工作液的1/5。以96孔板为例，每孔需加入20 μL大约1.5×104个细胞。	加入等体积的Amplex red/H₂O₂工作液，混匀。以96孔板为例，每孔需加入50 μL Amplex red/H₂O₂工作液。

注意事项：

样本浓度优化：极高浓度的H₂O₂或过氧化物酶可能导致荧光强度低于中等浓度（如25 μM），因为过量H₂O₂会将反应产物试卤灵氧化为无荧光的刃天青（resazurin）。首次实验建议对样品进行梯度稀释并进行检测，选择信号值位于整个结果曲线线性变化区域的浓度，确定最佳上样量。

孵育和检测

步骤	终点检测法	动力学检测法
1	室温避光孵育30分钟。	立即使用酶标仪进行检测。
2	使用酶标仪进行检测。	在所需时间段内的多个时间点（比如间隔5分钟）重复检测检测荧光或吸光度，以追踪反应动力。每次检测完需要将板放回培养箱，注意避光。

注意事项：

孵育时间优化：对新的实验体系建议按照动力学检测的流程进行孵育时间测试，每5分钟进行一次检测，选择信号稳定、强度高且处于增长期的时间点。

数据分析

►

每个数据点减去无H₂O₂对照孔的数值，扣除背景荧光或吸光度。

►

以浓度为X轴，荧光强度为Y轴，绘制线性回归方程：y=kx+b（R²>0.99）

►

样品的校正后的荧光强度或吸光度代入方程，计算得到样品中H₂O₂的终浓度

►

乘以稀释倍数，得到原始样品中的H₂O₂浓度

常见问题

反应没信号

可能是检测体系中的辣根过氧化物酶（HRP）或其他酶失活、过氧化氢已降解，或者样品中存在某些成分正在消耗过氧化氢或灭活检测所需的酶。请勿使用超过保质期的试剂。

Amplex red在KRPG中变为粉红色

Krebs-Ringer缓冲液的成分本身不会导致安普莱红试剂氧化为粉红色。可能是配置KRGB所用的水有污染。另一种解决方案是在使用前对缓冲液进行脱气处理，去除溶解的氧自由基。

案例一 PNAS（IF=9.1）

Amplex Red的作用 作为特异性荧光探针，与HRP联用。通过反应体系出现的特征红色及对应荧光信号，确认H₂O₂的生成，验证油水界面水微滴中羟基自由基重组自发生成H₂O₂的过程，而H₂O₂是驱动Au³⁺还原为单质金的重要还原剂之一。

样本类型

生化样本（化学反应后的溶液）

检测类型

H₂O₂检测（定性）

标题 Oil–water interfaces drive gold precipitation via microdroplet chemistry in thermal geological systems

客户单位 中国石油大学、青岛海洋科学与技术中心、美国斯坦福大学

引用产品 Amplex Red（C4839）

研究简介

传统金成矿模型无法解释富烃沉积盆地中稀含金热液与烃类交汇区高品位自然金的形成，油水界面水微滴的化学作用此前被忽视。

作者通过高温高压原位热实验，结合SEM、TEM、EPR等技术，探究140-400℃下不同油相与含金溶液体系的反应，观测水微滴演化与金沉淀过程。结果显示，油水界面水微滴自发产生电子、氢原子和过氧化氢，将Au³⁺还原为单质金，经微滴聚结形成纳米至微米级金颗粒，产物纹理与天然矿床一致。该机制为富烃区金成矿提供新解释，也为电子垃圾提金提供无额外还原剂的简化路径。

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案例二 Journal of Hydrology（IF=6.3）

Amplex Red的作用 用于测定土壤中PPO和POD的活性，显示高低水位处理间PPO和POD活性无显著差异。

样本类型

环境样本（土壤样本）

检测类型

过氧化物酶检测

标题 The role of water regime in soil organic carbon preservation in mangrovewetlands: “iron gate” vs. “enzyme latch”

客户单位 广东工业大学

引用产品 Amplex Red（C4839）

研究简介

红树林湿地仅占全球海岸0.5%却储存了大量的土壤有机碳，学界认为土壤有机碳（SOC）保存与海平面上升造成的酶的抑制（主要是酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD））或铁的价态变化有关。作者采集淇澳岛淹水与非淹水红树林土壤，设置60%和120%田间持水量开展60天培养实验，测定铁形态、酶活性、碳矿化特征及微生物群落变化。结果显示，红树林SOC主要受铁调控。水位下降时，土壤接触氧气，二价铁被氧化成三价铁。三价铁会通过共沉淀、络合作用结合SOC，形成Fe-SOC复合物。水位上升缺氧时，微生物会把三价铁还原成二价铁，Fe-SOC复合物中的碳会被释放出来，变成可溶性有机碳（DOC）。

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APExBIO未独立实验确认以上方法的准确性，仅供参考。

今天的Amplex Red检测攻略就分享到这里啦。觉得有用的话，别忘了点赞收藏转发给身边的实验伙伴～关注我们，后续还会更新更多荧光探针的实战技巧和顶刊应用方案。

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步骤	H₂O₂检测	活细胞H₂O₂检测	过氧化物酶活性检测
1	加入样本。以96孔板为例，每孔需加入50 μL样本（包括标准曲线样本）	加入Amplex red/HRP工作液，离心。以96孔板为例，每孔需加入100 μL Amplex red/HRP工作液。将反应混合液37℃预热10分钟。	加入含有过氧化物酶样本。以96孔板为例，每孔需加入50 μL样本（包括标曲样本）
2	加入等体积的Amplex red/HRP工作液，混匀。以96孔板为例，每孔需加入50 μL Amplex red/HRP工作液。	加入悬浮于KRPG缓冲液的细胞，体积为Amplex red/HRP工作液的1/5。以96孔板为例，每孔需加入20 μL大约1.5×104个细胞。	加入等体积的Amplex red/H₂O₂工作液，混匀。以96孔板为例，每孔需加入50 μL Amplex red/H₂O₂工作液。