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干货分享 | ADC“制造密码”：抗体、连接子、载荷偶联指南

2026-01-28 13:20:34

ADC的设计是一场精密的“系统工程”，抗体、载荷、连接子的选型与合成路线的设计环环相扣，直接决定最终产品的疗效与安全性。

此前我们已详解ADC的设计逻辑（点击查看），而当抗体、连接子、载荷的核心参数确定后，“组装”环节——即连接子与载荷、连接子与抗体的偶联，成为将设计蓝图落地的关键。

今天，我们就深入拆解这两步偶联的核心方法、技术细节与避坑指南。

连接子与载荷的偶联

连接子与载荷的偶联是ADC合成的第一步，核心是通过稳定的化学键将细胞毒性载荷锚定在连接子上。早期的ADC研发过程中经常连接连接子和载荷的前体，再通过添加基团或碳链增长完善结构，而现在更倾向于直接连接预先合成完整的连接子与载荷。目前主流以硫醚键、酰胺键偶联为主，其他方式根据载荷特性与释放需求灵活选用。

硫醚键偶联

连接子的NHS基团与载荷的巯基发生迈克尔加成反应，形成硫醚键，是目前ADC研发中最常用的偶联类型。其优势在于反应条件温和、反应效率高，且硫醚键在血液中稳定性良好。

SMCC与DM1的硫醚键偶联

（DOI: 10.1007/978-3-031-83005-1）

酰胺键偶联

连接子的活性基团（如羧基或NHS）与载荷的氨基发生亲核取代反应，形成稳定的酰胺键。酰胺键稳定性强，尤其适合毒性强、对脱靶效应耐受度低的载荷。

val-cit-PABC与MMAF前体酰胺键偶联

（DOI: 10.1021/bc800289a）

腙键偶联

连接子的肼基与载荷的羰基结合形成腙键。腙键本身就是一个酸敏感裂解位点，无需重新设计可裂解连接子。腙键的致命缺陷是血液中稳定性不足，易发生缓慢水解导致载荷提前释放，引发脱靶毒性，目前已逐渐被更稳定的化学键替代。

Mylotarg（Gemtuzumab ozogamicin）中载荷与各种连接子的腙键偶联

（DOI: 10.1021/bc010021）

酯键形成

连接子的羧基（-COOH）与载荷的羟基（-OH）反应，适合亲水性载荷的偶联，但反应过程需脱水催化（如使用 EDC/DCC 作为缩合剂）。酯键具有酸敏感性，无需重新设计可裂解连接子，且适合本身疏水性强、易聚集的载荷，能改善后续与抗体偶联后的整体溶解性。

Sulfo-NHS-SMPP与DM4的前体（May-OH）通过酯化反应偶联

（DOI: 10.1021/bc100480a）

二硫键交换反应

连接子携带的吡啶二硫基（-S-S-吡啶）与载荷的巯基发生二硫键交换，形成新的二硫键（-S-S-）。二硫键在肿瘤细胞高浓度谷胱甘肽GSH的还原作用下会断裂，无需重新设计可裂解连接子。

sulfo-NHS-SMPP-DM1通过二硫键交换反应偶联的过程

（DOI: 10.1021/bc100480a）

注

连接子-载荷偶联的注意事项

①

保护载荷药效团

载荷的细胞毒性依赖特定化学结构，偶联位点必须避开这些关键药效团。同时偶联反应需严格控制条件，避免破坏酯键或肽键完整性。

②

保证化学键稳定性

连接子与载荷间的化学键需要在血液循环中的保持稳定，防止提前释药，降低脱靶风险。酰胺键、硫醚键的稳定性显著优于腙键、酯键，若载荷毒性极强，优先选择酰胺键或硫醚键。

连接子和抗体的偶联

随机偶联

随机偶联是最早且最广泛应用的偶联策略，通过抗体表面天然氨基酸残基与连接子随机连接，可以分为赖氨酸偶联和半胱氨酸偶联。随机偶联操作简单、成本低，但是产物异质性强，同一批次中也会出现载荷负载量不一致。

赖氨酸偶联和半胱氨酸偶联的位点

（DOI: 10.1007/978-3-031-83005-1）

赖氨酸偶联

抗体表面暴露的赖氨酸残基的氨基可与连接子末端的NHS酯基团发生亲核取代反应，形成酰胺键。该方法的优势是无需预处理抗体，直接反应即可，且酰胺键稳定性极高，几乎不会在血液循环中断裂。

各种连接子与赖氨酸残基的偶联

（DOI: 10.1039/d1cc03976h）

半胱氨酸偶联

将抗体中的半胱氨酸之间的二硫键还原成巯基，与连接子上的马来酰亚胺基团（Maleimide）发生迈克尔加成反应，生成稳定的硫醚键。该方法的优势是巯基位点集中在铰链区，远离抗原结合区，对抗体活性影响较小，且均一性略优于赖氨酸偶联。

半胱氨酸偶联

（DOI: 10.1016/j.biotechadv.2015.05.001）

位点特异性偶联

位点特异性偶联技术通过在抗体上引入工程化的偶联位点实现载荷的定点连接，可以解决随机偶联的异质性问题，提高ADC均一性和稳定性，但成本高，工艺复杂。

工程化半胱氨酸偶联

在抗体恒定区特定位点引入半胱氨酸突变，形成单一的半胱氨酸偶联的位点。偶联位点远离抗原结合区，可以避免影响抗原结合亲和力和内吞效率。无需还原已有的二硫键，不会破坏抗体结构。

主流的工程化半胱氨酸偶联方法——ThioMAb技术

（DOI: 10.1002/cbic.202500305）

非天然氨基酸偶联

在抗体合成过程中掺入带修饰的氨基酸。如乙酰基苯丙氨酸（pAcPhe）可通过一个酮基与烷氧基胺衍生化药物选择性偶联，形成稳定的肟键连接。叠氮甲基-L-苯丙氨酸（pAMF）可以通过点击化学与药物分子发生反应。

酶辅助偶联

利用酶（如MTG、FGE、Sortaes A、Endo S）识别抗体上的特定序列，并通过连接子的氨基将连接子偶联到特定位点。

MTG偶联衍生方法

（DOI: 10.1007/s11274-020-02829-y）

注

偶联过程中需重点注意的核心问题

连接子-抗体偶联方法直接影响ADC的稳定性、疗效和安全性，需要重点关注以下三个问题。

①

DAR值的一性

DAR是Drug-to-Antibody Ratio（药物-抗体比值）的缩写，指的是每个抗体分子上平均偶联的药物分子数量。无药抗体（DAR=0）无治疗活性。高负载抗体（DAR>4）易因疏水性聚集，被机体快速清除，且可能增加毒性。因此，DAR一般需要在1~4的范围内进行优化，但近年来某些新型ADC的DAR可以达到8。

随机偶联DAR波动范围大，在0-8之间。低效偶联物的占比较高，会影响治疗效果。早期研发阶段可选择随机偶联。而用于长期治疗的商业化ADC产品优先选择位点特异性偶联，这样可以保证DAR的均一性和生产工艺的可重复性。

②

偶联稳定性

抗体与连接子需要形成稳定的共价键，防止载荷受血液中还原剂（如谷胱甘肽）的影响提前释放，导致对正常组织的脱靶毒性。

③

抗体功能保留

偶联可能导致抗体空间构象改变，影响其与肿瘤抗原的结合亲和力，或降低内吞效率。选择远离抗原结合区的偶联位点，可以避免破坏抗体的结构和活性。

撤市又上市的Mylotarg：偶联设计失误的警示与补救

在FDA批准的抗肿瘤药物中，很少有药物能有像Mylotarg一样曲折的经历。Mylotarg先是因为偶联方法设计中的问题导致的副作用撤市，又通过调整使用剂量绝境翻盘重新上市。

20 世纪 90 年代，为解决急性髓系白血病（AML）治疗中化疗药物无差别杀伤的困境，美国辉瑞公司的研发团队瞄准AML特异性抗原CD33开发了当时的第一款ADC——Mylotarg（Gemtuzumab ozogamicin）。抗体选择抗CD33的hP67.6，载荷用高毒性的卡奇霉素，连接子选用4-(4-乙酰苯氧基)丁酸（AcBut）。研究人员先将卡奇霉素（BA1006）制成肼衍生物，再与含羰基的AcBut连接子脱水形成腙键，之后在连接子的另一端添加NHS基团，与抗体的进行赖氨酸偶联，完成整体偶联。按照研究人员的预期，这个合成路线的设计可谓是一举两得：腙键不仅牢牢绑定载荷与连接子，又恰好形成了一个酸敏感的可切割位点。一旦ADC被CD33介导内吞进入AML细胞溶酶体（pH≈4.5），腙键会快速水解裂解，精准释放卡奇霉素杀伤肿瘤细胞。

Mylotarg的释药原理

（DOI: 10.1007/978-3-031-83005-1）

2000年，Mylotarg 凭借靶向优势获得FDA加速批准上市。上市后，精准释药的Mylotarg确实为部分不耐受传统化疗的老年复发AML患者带来了希望，也验证了ADC的治疗潜力。然而临床研究显示，5%的患者出现致命性肝静脉闭塞病（VOD），99%的患者发生3-4级血小板减少，早期的死亡率也较高。这些副作用出现是因为腙键在血浆会缓慢水解，会提前释放卡齐霉素，损伤正常细胞。

2010年，Mylotarg黯然撤市。

撤市后，世界各地的研究者并没有放弃挽救Mylotarg，因为Mylotarg靶向CD33的精准性和卡奇霉素的强效杀伤，仍是它对抗AML的核心优势，只是需要攻克临床结果与预期不符的问题。

法国凡尔赛-圣康坦大学米尼奥医院的研究团队发现：真正的关键是当时FDA 推荐的高剂量。通常腙键缓慢水解释放的少量游离卡奇霉素并不致命，高剂量才是毒性放大的核心诱因。于是这些法国研究者在实验中将9mg/m²（每14天两次）单次给药改为3mg/m²分次给药（第 1、4、7天）。试验结果令人振奋：完全缓解率达26%，VOD发生率降至0%，早期死亡率从17%降至9%。

2017年，基于这一优化方案及多项验证试验，FDA 批准Mylotarg再次上市。Mylotarg撤市又上市的故事留下了深刻的行业启示：ADC各设计要素环环相扣，任一环节的偏差都可能引发致命问题；而即便药物上市后暴露出问题，只要找准核心症结，通过临床方案调整、剂量优化等补救手段，仍有可能让有价值的药物重获新生。

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小结：偶联方法怎么选？

总的来说，偶联方法关键要平衡偶联稳定性、抗体功能保留与载荷活性，最终实现疗效与安全性的统一。同时，偶联方法的选择核心要匹配ADC的研发阶段与核心需求。比如，早期研发可以选择操作灵活的随机偶联，商业化生产则以位点特异性偶联为主。连接子与载荷的偶联需优先选择硫醚键、酰胺键等稳定共价键。即便合成后的ADC在体内实验中暴露问题，也无需全盘否定，可通过剂量优化等临床策略针对性修正，最大化药物价值。

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ADC载荷

货号	名称（英文）	CAS号	简介
A3631	Monomethyl auristatin E（MMAE）	474645-27-7	奥里斯他汀类微管抑制剂载荷（MMAE）
B3270	MMAF	745017-94-1	奥里斯他汀类微管抑制剂载荷（MMAE衍生物）
BA2321	DM1	139504-50-0	美登素类微管抑制剂载荷
BA2323	DM4	796073-69-3	美登素类微管抑制剂载荷（DM1衍生物）
BA2643	DM21	2243689-80-5	美登素类微管抑制剂载荷（DM1衍生物）
C8675	Tub114	2361406-35-9	新型微管抑制剂类载荷
N2133	SN-38	86639-52-3	喜树碱类DNA损伤诱导剂（TOPO I抑制剂）
BA1006	卡奇霉素（Calicheamicin）	108212-75-5	经典DNA损伤诱导剂，可破坏DNA双链
BA2320	Dxd	1599440-33-1	喜树碱类DNA损伤诱导剂（TOPO I抑制剂）
BA2324	SG3199	1595275-71-0	PBD二聚体类DNA损伤诱导剂，可结合

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ADC连接子

货号	名称	CAS号	切割类型	核心功能特征
A9978	Hydroxy-PEG2-(CH2)2-Boc	133803-81-3	非可切割连接子	PEG2链+保护基，提高水溶性
A9979	Hydroxy-PEG4-(CH2)2-Boc	518044-32-1	非可切割连接子	PEG4长链+保护基，延长连接臂
BA2366	MC-Val-Cit-PAB	159857-80-4	可切割-肽酶敏感型	Val-Cit二肽+间隔基
BA2394	Gly-Gly-Phe-Gly-NH-CH2-O-CH2COOH	1599440-20-6	可切割-肽酶敏感型	GGFG四肽序列，蛋白酶识别
BA2403	Fomc-Gly-Gly-Phe-Gly-OH	1817857-75-2	可切割-肽酶敏感型	保护基修饰GGFG四肽
BA2529	Propargyl-PEG5-amine	1589522-46-2	非可切割连接子	炔基+PEG5链，点击化学适配
BA2539	m-PEG11-Amine	854601-60-8	非可切割连接子	长链PEG，提升水溶性
BA2545	Fmoc-NH-PEG5-CH2COOH	635287-26-2	非可切割连接子	Fmoc保护+PEG5 链
BA2547	1-Cbz-3-Hydroxyazetidine	1279680-68-0	非可切割连接子	环烷基骨架，增强稳定性
BA2571	Val-Cit	159858-33-0	可切割-肽酶敏感型	Val-Cit二肽可裂解序列
BA2580	Propargyl-PEG2-NHBoc	869310-84-9	非可切割连接子	炔基+PEG2链+保护基
BA2587	Fmoc-NH-PEG6-CH2COOH	437655-96-4	非可切割连接子	长链PEG+保护基
BA2613	Fmoc-Gly-Gly-Phe-OtBu	236426-37-2	可切割-肽酶敏感型	保护基修饰GGF三肽
C6575	H-Val-Ala-OH	27493-61-4	可切割-肽酶敏感型	Val-Ala二肽可裂解序列
C8670	Gly-Gly-Phe-Gly（GGFG）	200427-88-9	可切割-肽酶敏感型	四肽蛋白酶识别序列
C8673	Azide-PEG1-Val-Cit-PABC-OH	2055041-40-0	可切割-肽酶敏感型	叠氮+PEG1+Val-Cit
BA2379	Fmoc-Val-Cit-PAB	159858-22-7	可切割-肽酶敏感型	Fmoc保护+Val-Cit-PAB序列
C8671	Fmoc-Ala-Ala-Asn(Trt)-OH	1951424-92-2	非可切割连接子	Fmoc+Trt双保护+ 三肽序列
C8681	4-(4-Acetyl-phenoxy)-butyric acid	65623-82-7	非可切割连接子	乙酰基修饰+羧酸连接位点
BA2364	SMCC	64987-85-5	非可切割连接子	NHS酯+马来酰亚胺，氨基-巯基偶联
BA2367	DBCO-amine	1255942-06-3	非可切割连接子	DBCO基团，无铜点击化学偶联
BA2378	SPDP	68181-17-9	可切割-还原敏感型	吡啶二硫基+NHS酯，二硫键交联
BA2388	sulfo-SPDB	1193111-39-5	可切割-还原敏感型	水溶性二硫基+NHS酯
BA2402	DBCO-Maleimide	1395786-30-7	非可切割连接子	DBCO+马来酰亚胺，双功能偶联
BA2443	DBCO-PEG4-Maleimide	1480516-75-3	非可切割连接子	DBCO+PEG4+马来酰亚胺
BA2456	Propargyl-PEG2-amine	944561-44-8	非可切割连接子	炔基+PEG2+氨基，双功能偶联
BA2469	DBCO-C6-acid	1425485-72-8	非可切割连接子	DBCO+羧基，点击化学+羧基偶联
BA2485	Mal-PEG1-Val-Cit-PABC-OH	2055041-37-5	可切割-肽酶敏感型	马来酰亚胺+PEG1+Val-Cit
C3773	Disuccinimidyl Glutarate(DSG Crosslinker)	79642-50-5	非可切割连接子	双NHS酯，氨基-氨基交联
C8672	DBCO-Val-Cit-PABC-PNP	2994332-18-0	可切割-肽酶敏感型	DBCO+Val-Cit+PNP活性酯
C8674	Azido-PEG1-Val-Cit-PABC-PNP	-	可切割-肽酶敏感型	叠氮+PEG1+PNP活性酯
B1003	Mc-Val-Cit-PABC-PNP	159857-81-5	可切割-肽酶敏感型	Mc活性基团+Val-Cit+PABC+PNP活性酯
BA2428	SPP	341498-08-6	可切割-还原敏感型	吡啶二硫基+NHS 酯，二硫键交联

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载荷-连接子偶联物

货号	名称（英文）	CAS号	连接子和载荷
BA2624	CL2A-SN-38	1279680-68-0	连接子：CL2A 载荷：SN-38
BA2651	MC-SN38	1473403-87-0	连接子：MC 载荷：SN-38
BA2628	SMCC-DM1	1228105-51-8	连接子：SMCC 载荷：DM1
BA2676	Val-Ala-PAB-MMAE	1912408-92-4	连接子：Val-Ala-PAB 载荷：MMAE
BA2680	Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAE	1650569-89-3	连接子：Ac-Lys-Val-Cit-PABC 载荷：MMAE
BA2685	MC-EVCit-PAB-MMAE	2873452-49-2	连接子：MC-EVCit-PAB 载荷：MMAE
BA2705	Azido-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE	1869126-64-6	连接子：Azido-PEG4-Val-Cit-PAB 载荷：MMAE
BA2708	Cyclooctyne-O-amido-PEG4-VC-PAB-Gly-Gly-NH-O-CO-Exatecan	2699066-62-9	连接子：Cyclooctyne-O-amido-PEG4-VC-PAB-Gly-Gly-NH-O-CO- 载荷：Exatecan
BA2711	Val-Ala-PABC-Exatecan	2845164-91-0	连接子：Val-Ala-PABC 载荷：Exatecan

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