在分子生物学研究中，转录调控是基因表达调控的关键环节之一。转录因子通过与启动子区域的特异性结合，调控基因的转录活性，从而影响细胞的功能和发育。双萤光素酶报告基因检测系统是一种经典的实验技术，广泛应用于转录调控研究。该系统利用萤火虫萤光素酶（Firefly Luciferase, FLuc）和海肾萤光素酶（Renilla Luciferase, RLuc）的发光特性，通过检测两种萤光素酶的活性比值，可以排除细胞生长状况、转染效率等因素的干扰，从而准确评估转录因子的调控作用。

a. 实验首先需要选择合适的主报告基因载体，比如市面常用的萤光素酶报告基因载体（pGL3、pGL4、pGL6等）。此外，为了归一化实验结果，一般需要引入内参报告基因，如海肾萤光素酶，可以直接使用商品化的载体pRL-TK。

如研究转录因子对启动子的调控作用，需要将目标基因的启动子区域（通常约2000 bp）克隆到萤光素酶报告基因载体的上游。

如只需检测转录因子活性，也可以直接选择商品化质粒（见下表），可以直接用于该转录因子活性的研究，大大节约了实验时间。

b. 报告基因载体构建成功后还需要将需要研究的转录因子的编码序列克隆到适合的表达载体（如pcDNA3.1）中。

质粒构建成功后就可以进行细胞转染。如研究转录因子对启动子的调控作用，可以参考下表进行分组。一般双萤光素酶报告基因实验选择瞬时转染即可。实验中可以对主报告基因和内参报告基因的转染比例进行优化。

转染后24-48 h，即可收集细胞并用双萤光素酶报告基因检测试剂盒进行检测。如果是研究化合物对转录因子活性的调控，可以在转染一定时间后继续加入化合物处理细胞一段时间再进行检测。

案例一：

肝内胆管癌（ICC）是继肝细胞癌之后的第二常见的原发性肝癌，研究ICC的发病机制对于临床有重要意义。已知锌指蛋白263（ZNF263）在ICC中高表达但其作用机制尚不清晰，研究人员进一步研究发现其可能与ULK1有关。为了探究转录因子ZNF263是否可以通过结合ULK1调控其活性，作者将ULK1的增强子区域克隆到了pGL3载体上，结果显示外转ZNF263显著增强萤光素酶信号，而将ULK1增强子突变后信号就显著下降，这些结果证明ZNF263可以结合ULK1并调控其活性。本文章中使用APExBIO的Dual Luciferase Assay System（货号：K1136）进行双萤光素酶报告基因实验。

引用自：Mol Carcinog.2025 Feb;64(2):317-328.

呼吸道感染是全球发病率和死亡率的主要原因之一，但棒状杆菌在呼吸道健康和疾病中的具体作用尚不清楚。研究人员将几种棒状杆菌（Cp1、Cp2、Cps1、Cps2）接种到呼吸道上皮细胞NCI-H292上，为了进一步检测杆菌对细胞的影响，他们将pNFkB-luciferase质粒和pTK-Renilla luciferase质粒瞬时转染到细胞中进行双萤光素酶报告基因实验，结果显示杆菌可以显著引起细胞内NFkB活性上升，说明杆菌可以诱导细胞内的炎症反应。

引用自：Front Cell Infect Microbiol. 2025 Jan 28;14:1530178.