无缝克隆技术，特别是Gibson Assembly技术，是一种在分子生物学领域具有革命性的克隆方法。它由Daniel Gibson和J. Craig Venter在2009年发展起来，极大地简化了基因工程过程，提高了克隆效率和准确性。Gibson Assembly技术的原理是通过外切酶产生黏性末端，再通过同源重组酶的连接得到重组片段。该技术可以实现多个DNA片段的无缝组装，不受片段长度和末端兼容性的影响，只需要片段末端有不同的重叠部分（15-30bp）。

Gibson组装技术由Daniel G. Gibson博士及其团队于2009年首次提出，是一种高效且灵活的DNA片段组装方法。它以能够轻松组装多个DNA片段而闻名，也可用于将目的片段插入特定载体中完成基本克隆。简单来说，Gibson组装的核心步骤是：首先通过PCR扩增获得末端带有同源区域的DNA片段，然后将这些片段与酶混合物（enzyme master mix）共孵育以完成连接。酶混合物包含三种关键酶：T5核酸外切酶用于消化片段的5'末端，产生长的单链突出末端，使同源区域能够退火；Phusion聚合酶用于填充缺口；Taq连接酶用于连接切口。这些酶能够在同一温度下工作，因此整个反应在50℃孵育1小时或更短时间即可完成。反应结束后，连接产物可直接转化入感受态细胞中。

Gibson Assembly不依赖限制性内切酶，可一步完成多个DNA片段的组装，大大提升DNA组装速率，同时还可降低载体自连的概率，是多片段DNA序列连接的首选方式。此外，Gibson Assembly技术还适用于多片段的组装，与传统一段一段构建方法相比，Gibson Assembly技术一步即可完成多个片段的构建。这种技术使得构建大型DNA分子、基因组和人工染色体变得更加简单和可行，广泛应用于基因克隆与片段组装、基因突变研究、蛋白质工程与代谢工程、合成生物学等领域。

产品介绍

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产品优势

无缝克隆技术的优势在于它不受限于酶切位点，可以适用于任意载体、任意片段，操作更加灵活。此外，它还具有高效率，阳性克隆高达90%以上，可以一次进行多片段目的基因的重组。无缝克隆技术的应用非常广泛，包括基因克隆与片段组装、基因突变研究、蛋白质工程与代谢工程、合成生物学等领域。详情可见下表：

实验流程

无缝克隆技术的实验流程主要包括：载体线性化、目的片段制备、孵育和转化等过程。这种技术不仅提高了实验的效率，还降低了操作的复杂性，使得更多的科研人员能够轻松地进行分子克隆实验。

相关文献：在临床前研究中开发针对实体瘤的ROR1靶向CAR-T细胞

嵌合抗原受体（CAR）修饰的T细胞（CAR-T）在对抗B细胞恶性肿瘤方面已展现出令人鼓舞的临床益处。然而，将其应用于实体瘤治疗仍面临挑战。与血液系统恶性肿瘤不同，实体瘤往往缺乏理想的靶点，这些靶点最好仅在肿瘤细胞上表达，而不在正常健康细胞上表达。幸运的是，受体酪氨酸激酶样孤儿受体1（ROR1）是少数几个理想的癌症靶点之一，它在多种肿瘤上异常表达，但在正常组织中表达较低，这使其成为CAR-T疗法的一个良好候选靶点。在此，我们构建了两种ROR1 CAR，它们具有相同的抗原识别域，该域源自Zilovertamab，但在铰链区有所不同。两种CAR均能特异性靶向ROR1阳性癌细胞，但具有较短IgG4铰链区的CAR在细胞表面表达更高，且体外功能更强。我们进一步在三种人源实体瘤异种移植小鼠模型中测试了ROR1 CAR-T细胞。我们的ROR1 CAR-T细胞能够控制实体瘤的生长，且未引起任何严重毒性。我们的研究结果表明，源自Zilovertamab的ROR1 CAR-T在体外和体内对ROR1阳性实体瘤具有高效性和安全性，为未来的临床治疗提供了一种有前景的治疗选择。

文章链接：

Lee BK, Wan Y, Chin ZL, Deng L, Deng M, Leung TM, Hua J, Zhang H. Developing ROR1 Targeting CAR-T Cells against Solid Tumors in Preclinical Studies. Cancers (Basel). 2022 Jul 25;14(15):3618. doi: 10.3390/cancers14153618. PMID: 35892876; PMCID: PMC9331269.

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