非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS以及疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，其分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义。

在电场中，带正电荷的蛋白质会向阴极移动，带负电荷的蛋白质则向阳极移动，移动的速度取决于蛋白质所带电荷的多少和蛋白的形状等特点。碱性蛋白一般建议在微酸性环境下电泳，此时蛋白带正电荷，向负极运动，此情况相反于SDS-PAGE，需要将正负极对调。

表1 SDS PAGE和Native PAGE的区别汇总表

分类

• Native PAGE：

是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质（PI>7或≤7）进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。其分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，可以得到较高的分辨率。

• Blue native PAGE ( BN-PAGE)：

考马斯亮蓝G -250代替SDS作为电荷携带者和复合物稳定剂结合到蛋白质上，赋予蛋白质负电荷，使其在电场中向阳极移动。由于蛋白保持其天然状态，可实现非变性条件下电泳，蛋白分离差异来自于有效电荷差异、分子形状和分子量大小。该技术在生物膜、全细胞及组织匀浆等样本中一步分离蛋白质复合物，测定天然蛋白质的分子量、寡聚状态以及识别生理性蛋白质-蛋白质相互作用等方面有重要用途。分离的天然复合物可通过电洗脱法（Electroelution）或扩散法（Diffusion）从凝胶中回收，随后用于2D结晶和电子显微镜分析，或通过凝胶内活性测定、天然电印迹及免疫检测进行分析。

此方法特别适合蛋白质-蛋白质相互作用以及膜蛋白复合物方面研究，其分离范围在100 KDa-10 MDa。但是需注意G-250对弱结合复合物以及部分蛋白活性的影响。

• Clear native PAGE（CN-PAGE）：

是一种在丙烯酰胺梯度凝胶中分离水溶性蛋白和膜蛋白（PI<7.0）的电泳技术，迁移距离取决于蛋白质的固有电荷和梯度凝胶的孔径。BN-PAGE和CN-PAGE的缓冲液和电泳条件一致，但是CN-PAGE的阴极缓冲液中不含考马斯染料，而是将0.025%的洋地黄皂苷加入到凝胶中。CN-PAGE分辨率通常低于BN-PAGE，但当考马斯染料G-250干扰进一步分析天然复合物时，CN-PAGE具有显著优势，例如线粒体ATP合成酶催化活性的测定或用于荧光共振能量转移（FRET）分析的膜蛋白复合物的有效微型分离。CN-PAGE比BN-PAGE温和，特别适用于研究蛋白质-蛋白质相互作用以及后续的质谱联用。

• Quantitative preparative native continuous PAGE（QPNC-PAGE）：

是一种连续型聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，基于蛋白质等电点实现分离，主要用于分离生物样品中的活性或天然金属蛋白（如金属伴侣蛋白、朊病毒、金属转运蛋白、淀粉样蛋白、金属酶、金属肽等），并解析复杂蛋白质混合物中正确和不正确折叠的含金属辅因子的蛋白质。QPNC适合于分子量为6-200 kDa的酸性、碱性和中性金属蛋白。QPNC-PAGE、SEC、ICP-MS和NMR的组合应用对于阐明患者生理学相关金属蛋白的结构以及改善蛋白质错误折叠疾病的诊断和治疗有重要作用。

案例解析

案例1：

当使用BN-PAGE技术进行检测时，牛Cytbc1复合物被解析为一条清晰的单一条带，对应于分子量约为598 kDa，与二聚体Bc1的分子量一致，反映了纯化的复合物的真实寡聚状态；相同样品在Tricine-SDS-PAGE凝胶上产生至少10条条带（图1a），显示完整牛复合物的组成。另一方面，Rsbc1被解析为尖锐的主带（约310 kDa）以及的次带（约32 kDa），该结果与缺少亚基4的三亚基Rsbc1复合物的成功结晶和结构测定很好地对应。同一样品的Tricine-SDS-PAGE产生了四个分离良好的亚基（图1b）。总之，BN-PAGE提供了一个敏感的工具，用于监测溶液中的膜蛋白的单分散性、以及揭示蛋白聚集状态和晶体结构所相关性。

BN–PAGE analysis of membrane proteins with known crystal structures.^[1]

案例2：

在研究线粒体呼吸链复合物时，需要保持蛋白的天然活性和结构完整性以进行后续的功能分析。BN-PAGE因分辨率高、分子量和寡聚状态估算方便而更适用于标准分析中，但是CN-PAGE条件更温和，能保留BN-PAGE条件下会解离的呼吸链复合物超分子组装体，鉴定出了BN-PAGE未检测到的线粒体ATP合酶寡聚状态，是功能蛋白质组学研究的有用工具。Figure 1. Two-dimensional native resolution of rat heart mitochondrial complexes. ^[2]

Figure 2. 3-D SDS-PAGE identifying the constituent proteins of supercomplexes. ^[2]

案例3：

细胞因子（P1024）和抗体抑制剂（F1310）PAGE质检结果图

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参考文献

[1] Ma J, Xia D. The use of blue native PAGE in the evaluation of membrane protein aggregation states for crystallization. J Appl Crystallogr. 2008 Dec 1;41(Pt 6):1150-1160. doi: 10.1107/S0021889808033797. Epub 2008 Nov 11. PMID: 19529836; PMCID: PMC2648668.

[2] Wittig I, Schägger H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 2005 Nov;5(17):4338-46. doi: 10.1002/pmic.200500081. PMID: 16220535.