钙离子（Ca²⁺）作为生物体内重要的第二信使，在众多生理过程中发挥着至关重要的作用。从神经信号的传导到肌肉的收缩，从细胞的增殖与分化到基因的表达调控，钙离子都扮演着不可或缺的角色。因此，准确地检测和分析细胞内或组织中的钙离子浓度变化，对于深入理解各种生理和病理过程具有极其重要的意义。

钙离子检测应用

a.药物筛选

GPCR家族是目前最大的药物开发靶点，开发方便且准确的筛选方法对于GPCR药物开发非常重要。钙流检测作为目前最常使用的检测方法之一，在GPCR药物筛选中发挥重要作用。

b.神经元活动

在神经科学研究中，钙成像技术被广泛用于观察神经元的活动，帮助理解大脑功能和神经疾病机制。

c.细胞信号传导

钙离子作为第二信使，在信号传导中发挥重要作用。检测在细胞信号传导中钙离子浓度的变化，可以更深入的了解信号转导机制和细胞功能调控。

d.疾病研究

已知钙离子稳态失调与许多疾病密切相关，检测钙离子变化有利于探究疾病机制和开展后续药物研发。

常见钙离子探针盘点

自上个世纪Roger Tsien团队开发出第一款钙离子荧光探针，经过几十年的发展，钙离子探针层出不穷，目前已有许多商品化的钙离子探针。但是目前最常用的钙离子探针主要为Fluo-4 AM，Fluo-3 AM，Rhod-2 AM，Fura-2 AM等。接下来我们分别来看看这几种钙离子探针的具体应用吧。

• Fura-2 AM

Fura-2 AM为第二代钙离子探针，是一种紫外光激发的比率型或双波长荧光染料。其激发特性与Ca2+浓度有关，当没有和Ca2+结合时，其激发峰为380 nm；当与Ca2+结合时，激发峰向短波方向340 nm处移动。分别以340 nm和380 nm进行激发，通过两种激发光对应的荧光强度比率计算Ca2+浓度。与其他非比率型探针相比，Fura-2 AM更适合定量分析，且可以消除不同细胞间装载效率的差异。

文献举例:

三氯蔗糖是一种甜味剂，为了探究其对细胞线粒体功能是否有影响，研究人员进行了一系列实验。因为钙离子在细胞内信号传递，特别是调节线粒体功能中发挥重要作用，研究人员使用三氯蔗糖刺激细胞，随后用Fura-2 AM检测细胞内钙离子的变化，结果显示三氯蔗糖刺激后，细胞内的钙离子浓度明显升高。

图1：通过Fura-2 AM检测细胞内钙离子

（引用自：Front Nutr. 2021 Jan 18;7:585484.）

• Fluo-3 AM/Fluo-4 AM

Fluo-3 AM为第三代钙离子探针，是一种单波长探针，其最大激发/发射波长分别为506 nm和526 nm。因为不必用紫外激发，相比于前二代探针，Fluo-3 AM可以大大的减少对细胞的损伤。Fluo-4 AM是在Fluo-3 AM基础发展出来的新一代探针，其荧光信号比Fluo-3 AM强1倍。因此近年来Fluo-4 AM的应用也越来越多。

文献举例:

与传统的2D细胞模型相比，类器官是一种3D模型，能更好的模拟细胞的生理状态。但是类器官也有一个瓶颈，就是在长期培养过程中会不断变大，类器官中心细胞由于营养供应不足常出现坏死。为了解决这一难题，东南大学的研究人员通过双光子激光直写技术（TPP）3D打印制造出了网状血管并用于脑类器官共培养。为了探究共培养的血管化脑类器官的功能，研究人员用Fluo-4对脑类器官进行钙成像，结果显示血管化脑类器官的钙信号更高，这说明其具有更高的成熟度。

图2：通过Fluo-4 AM检测类器官内钙离子变化

（引用自：ACS Nano. 2024 Sep 13;18(38):26201–14.）

• Rhod-2 AM

Rhod-2 AM也属于第三代钙离子探针。但是与Fluo系列不同的是，Rhod-2 AM独特的化学结构使得其非常容易留在线粒体中，因此Rhod-2 AM是最常用于检测线粒体Ca2+的探针。

文献举例:

线粒体作为细胞内的能量工厂，其功能障碍与多种疾病的发生发展密切相关。天津大学化工学院的研究人员设计出了一个DNA四面体（TDNs-G-TPP）用于线粒体干预。为了检测TDNs-G-TPP对线粒体中钙离子稳态的影响，作者使用Rhod-2 AM进行检测，结果发现TDNs-G-TPP处理后细胞线粒体内钙离子浓度更高。

图3：通过Rhod-2 AM检测不同处理后线粒体内钙离子浓度

（引用自：J Am Chem Soc. 2022 Mar 16;144(10):4667-4677.）

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