刺吸式口器害虫对农业危害极大，目前过度使用农药进行防治会使害虫产生抗药性，也会对环境产生破坏。RNA干扰（RNAi）已被证实是一种很有潜力的环境友好型生物防治技术。然而，由于植物对dsRNA的摄取和运输有限，使用RNAi技术清除刺吸式口器害虫的效果远不令人满意。

近日，华中农业大学课题组发表题为Nanoparticle LDH enhances RNAi efficiency of dsRNA in piercing-sucking pests by promoting dsRNA stability and transport in plants的研究论文。作者合成了一种层状双氢氧化物（LDH）的纳米颗粒，能够促进植物对其中装载的dsRNA的内化和运输效率，增强dsRNA在P. Citri害虫体内的稳定性，从而有效对P. Citri的关键基因Chit进行RNAi敲低而杀灭P. Citri，为害虫生态友好防治提供了一种有潜力的策略。该论文用于合成Cy3标记的dsRNA的试剂盒HyperScribeTM T7 High Yield Cy3 RNA Labeling kit (货号K1061)和原料Cy3-UTP(货号B8330)均由APExBIO提供。

研究结果

纳米颗粒表征

作者首先合成了CS-STPP、CQD-STPP、MgAl-LDH和SPC这四种装载dsRNA的纳米颗粒。通过琼脂糖凝胶电泳阻滞实验发现将dsRNA加载到CS-STPP、CQD-STPP、MgAl-LDH和SPC上的最佳质量比分别为3:1；1/100:1；5:1和1/3:1 (图1A)。通过DLS检测Nano-dsRNA的粒径、多分散性指数，四种Nano-dsRNA的粒径均在200 nm以下，多分散性指数在0.3以下（图1C）。采用紫外-可见分光光度法测量最佳质量比下，不同纳米颗粒对dsRNA的加载效率。结果表明，CS-STPP、CQD-STPP、MgAlLDH和SPC纳米颗粒对dsRNA的加载效率分别为84.68%、68.29%、86.40%和63.12%（图1E），其中CS-STPP和MgAl-LDH纳米颗粒具有较高的dsRNA装载效率。

图1. Nano-dsRNA的生成和表征。

纳米颗粒能增加P. Citri幼虫肠道中dsRNA的稳定性

接下来，作者选择P. Citri幼虫进行测试，研究纳米颗粒对RNAi效率的影响。直接给P. Citri幼虫喂食含有裸dsPcChit或四种纳米颗粒包被的dsPcChit。结果表明，与裸dsPcChit相比，CS-STPP-dsPcChit和MgAl-LDH-dsPcChit能够提高Chit基因敲低效率和幼虫死亡率(图2B-C)。为了弄清纳米颗粒提高幼虫体内RNAi效率的原因，作者测试了幼虫肠道中dsRNA的稳定性。使用Cy3标记dsRNA，荧光图像显示，CS-STPP-dsRNA-Cy3和MgAl-LDH-dsRNA-Cy3在24和48 h时产生的红色荧光信号比裸dsRNA-Cy3更强（图2D-E）。随时间延长，裸dsRNA-Cy3组的Cy3荧光强度逐渐降低 (图2D-E)。总之，CS-STPP和MgAl-LDH纳米颗粒能够提高幼虫肠道中dsRNA的稳定性，从而增强dsPcChit的杀虫效果。

图2. 纳米颗粒能够增加P. Citri幼虫肠道中dsRNA的稳定性，提高RNAi效率

MgAl-LDH纳米颗粒能促进dsRNA进入叶细胞

为了确定纳米颗粒是否会促进dsRNA进入叶片内，作者采用浸叶法(图3A）测定裸dsPcChit、CS-STPP-dsPcChit或MgAl-LDH-dsPcChit诱导的RNAi效率。结果表明，与裸dsPcChit相比，MgAlLDH-dsPcChit能显著提高基因敲除效率和幼虫死亡率，但CS-STPP-dsPcChit并不能有效触发RNAi (图3B-C)。为了弄清纳米颗粒提高幼虫RNAi效率的原因，作者采用共聚焦显微镜检测带Cy3标记的dsRNA进入叶片细胞的效率。结果显示，纳米颗粒能增强dsRNA在叶片表面的粘附能力，相比裸的dsRNA-Cy3，CS-STPPdsRNA-Cy3和MgAl-LDH-dsRNA-Cy3更不易从叶片上被洗掉，在叶片表面显示极强的红色荧光信号。并且与CS-STPP-dsRNA-Cy3和裸dsRNA-Cy3组相比，MgAl-LDH-dsRNA-Cy3在叶细胞中观察到最强的红色荧光信号(图3D-E)，说明MgAl-LDH纳米颗粒更能促进dsRNA-Cy3进入叶细胞。综上所述，CS-STPP和MgAl-LDH纳米颗粒均能增强dsRNA在叶片表面的粘附，但只有MgAl-LDH才能使dsRNA更快速进入叶片细胞，从而提高dsPcChit的RNAi效率和杀虫作用。

图3. 纳米颗粒促进dsRNA进入叶细胞，提高对P. Citri幼虫的RNAi效率。

MgAl-LDH纳米颗粒促进植株内dsRNA的转运效率

结合上述实验结果，作者重点将MgAl-LDH纳米颗粒作为研究对象，接着探讨MgAl-LDH能否促进dsRNA在植株中的转运效率。作者通过茎浸泡法(图4A)测定裸dsPcChit或MgAl-LDH-dsPcChit诱导的RNAi效率。结果表明，与裸dsPcChit相比，MgAl-LDH-dsPcChit对Chit基因的敲除效率提高25%，幼虫死亡率提高了9.9% (图4B-C)。同样，通过共聚焦显微镜观察Cy3标记的MgAl-LDH-dsPcChit从茎到叶片组织的转运效率。显示MgAl-LDH纳米颗粒能大幅促进dsRNA从茎到叶片的运输。在茎顶部、主脉和叶组织中，可以看出MgAl-LDH-dsRNA-Cy3相比裸dsRNA-Cy3组表现出更强的荧光强度 (图4D-E)。同时，作者还采用ddPCR方法分别检测茎和叶组织中dsPcChit的拷贝数。同样显示MgAl-LDH-dsRNA组的茎和叶内dsPcChit的拷贝数相比裸dsRNA组更多（图4F-G）。综上所述，MgAl-LDH纳米颗粒作为良好的dsRNA的载体，能够改善植株里的dsRNA从茎到叶片的长距离运输。

图4. MgAl-LDH可促进植株中dsRNA的运输，从而提高对P. Citri幼虫的RNAi效率。

MgAl-LDH-dsRNA能增强对P. Citri不同发育阶段的防控

为了研究MgAl-LDH-dsPcChit能否对P. Citri其他发育阶段进行有效防治，作者使用幼虫和成虫进行实验。比较直接喂食、浸叶法和茎部浸泡三种方式的RNAi效果。在幼虫实验中，与裸dsPcChit相比，MgAl-LDH-dsPcChit对于Chit基因的敲低效率虫死亡率都有显著提升(图5 A-B)。在成虫实验中同样具有相似的结果(图 5C-D)。总之，MgAl-LDH-dsPcChit对不同发育阶段的P. Citri均具有很好的防控能力。

图5. MgAl-LDH-dsRNA提高P. Citri幼虫和成虫的RNAi效率和死亡率。

LDH纳米颗粒在促进刺吸式口器害虫的RNAi效率和死亡率方面具有普遍性

最后，作者增设D. citri和A. gossypii两种害虫，以及设计MgAl-LDH-dsRNA和 MgFe-LDH-dsRNA两种LDH纳米颗粒，以确定LDH纳米颗粒对于促进刺吸式口器害虫的RNAi效率及死亡率的普适性。从D. citri的实验可以看出，与裸dsRNA (DcChs, DcChit, DcChs+DcChit)相比，MgAl-LDH-dsRNA和MgFe-LDH -dsRNA显著提高了靶基因的敲除效率，以及幼虫的死亡率（图6 A-D）。同样，在A. gossypii的实验里，与裸dsRNA (AgChs, AgChit, AgChs+AgChit) 相比，MgAl-LDH-dsRNA和MgAl-LDH-dsRNA同样显著提高了靶基因的敲低效率和幼虫的死亡率（图6E-H）。综上所述，LDH纳米颗粒对于提高刺吸式口器害虫的RNAi效率方面具有普适性。

图6. MgAl-LDH-dsRNA和MgFe-LDH-dsRNA提高D. citri和A. gosspii的RNAi效率

结论

综上所述，LDH纳米颗粒可以促进dsRNA在植物组织中的长距离运输，提高dsRNA在叶片表面的粘附能力以及进入叶片细胞的效率，并提高dsRNA在害虫肠道中的稳定性，为消灭刺吸式口器害虫提供了一种有前景的生态友好防治策略。