近日，上海交通大学附属仁济医院肾内科的牟姗的团队联合中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）陈洛南研究组在Advanced Science (IF=15.1)上发表Podocyte Pathogenic Bone Morphogenetic Protein-2 Pathway and Immune Cell Behaviors in Primary Membranous Nephropathy。该研究获得了包含大量样本的抗PLA2R自身抗体阳性PMN的单细胞转录组数据集，并通过研究PMN中足细胞、单核/巨噬细胞和B细胞的基因表达变化和相互作用，阐明了足细胞在PMN疾病发生机制中的作用及其引起的免疫环境的变化。其中单细胞转录组测序项目由APExBIO进行。

研究背景

慢性肾脏疾病（CKD）是一个影响人类健康的全球性问题，其中原发性膜性肾病（PMN）是非糖尿病成年人中最常见的肾病综合征类型。PMN是一种自身免疫性肾小球病，其组织病理学特征是GBM增厚和由细胞外基质（ECM）积累导致的上皮“尖刺”形成。COL4A3和COL4A4是GBM的两个主要ECM组分。

足细胞（podocyte），即肾小囊脏层上皮细胞，附着于肾小球基底膜（GBM）的外侧。足细胞在PMN发病机制中起着核心作用。PLA2R是PMN最常见的自身抗原，表达在人类足细胞表面。在PMN中，异常激活的免疫系统产生IgG4自身抗体，靶向足细胞表面的自身抗原，并沉积在肾小球亚上皮区域，触发补体系统的激活，最终导致足细胞和肾小球滤过屏障的功能受损。然而，调节免疫紊乱、足细胞损伤和GBM增厚的潜在途径仍然大部分未知，值得进行深入研究。

作者对11例PMN患者和7名对照组患者的肾活检样本进行了大规模的scRNA-seq，结合肾活检切片的免疫染色和足细胞体外培养等下游验证实验，展示了补体诱导的BMP2/pSMAD1/COL4途径在PMN中的作用，并揭示了PMN中肾B细胞和巨噬细胞的激活。

研究思路

研究结果

1 降维聚类结果

实验组（PMN）样本来自PLA2R自身抗体阳性的11例新诊断的PMN患者；对照组（Ctrl）样本来自7名肾功能正常的受试者（图1A）。对单细胞转录组数据进行细胞过滤，降维聚类，和细胞注释，确定了五个主群和十四个亚群：

01

肾小球和间质细胞，包括内皮细胞（Endos）、足细胞和肾小球壁上皮细胞（Podos&PECs）、人肾系膜细胞（HRMCs）和成纤维细胞（Fibros）。

02

B细胞（B）。

03

髓系免疫细胞，包括单核/巨噬细胞（Monos&Mpas和中性粒细胞（NEs））。

04

T/NK细胞，包括T细胞（T）和自然杀伤细胞（NKs）。

05

管型细胞，包括近曲小管（PT），远曲小管及Henle氏带环（DT&LOH），集合管-主细胞（CD-PCs）和集合管-间质细胞（CD-ICs）。

为得到更准确的结果，对肾小球和间质细胞进行二次降为聚类，得到足细胞（Podos）、肾小球壁上皮细胞（PECs）、EHD3+肾小球内皮细胞（G-Endos）、SEMA3G+动脉内皮细胞（A-Endos）、与升支和降支血管直径一起的肾小管周围内皮细胞（T-Endos）、HRMCs、血管平滑肌细胞（VSMCs）和成纤维细胞（Fibros）。Podos、PECs、HRMCs和G-Endos被确定为肾小球细胞，而A-Endos、T-Endos、VSMCs和Fibros被确定为间质细胞。足细胞（podocytes）通过四个已知的标记基因（PLA2R1、WT1、NPHS1和NPHS2）确认，共295个（图1）。

图1

2 PMN中肾小球和间质细胞的变化

在肾小球细胞中，足细胞的比例在实验组和对照组间没有显著差异。该现象与作者的假设和以前的研究相符，即补体成分的攻击导致损伤而不是足细胞的大量死亡。虽然PECs和G-Endos在Ctrl和PMN之间似乎显示出百分比的变化，但G-Endos、PECs和HRMCs在两组间的基因表达模式并没有差异，而足细胞呈现出了明显的组间基因表达差异。根据GSVA分析，PMN肾小球中，Podos、G-Endos和HRMCs中脂质转运、补体系统激活和体液免疫反应激活，而足细胞中GBM组分胞外基质合成通路激活，蛋白质重折叠、热休克蛋白（HSP）和NOD2信号通路下调。

在PMN中差异上调的足细胞基因中，BMP2是一个广为人知的骨发育诱导剂，属于转化生长因子β超家族。它与其可能的靶基因，两个主要的形成GBM外基质的基因COL4A3和COL4A4都表达较高。这些在PMN组足细胞中差异表达的基因富集在与GBM组分的外基质合成相关的GO通路。分析这些基因在PMN组中其他肾小球细胞中的表达水平，并于另外两项关于另一种常见蛋白尿疾病IgA肾病的研究数据联合分析，发现BMP2、COL4A3和COL4A4在PMN中的其他肾小球细胞或IgA肾病中的足细胞/HRMCs中没有上调。这样的分析表明这些差异基因在PMN足细胞中具有特异性表达，或者至少在IgAN中没有特异性表达。

此外，来自PMN患者的足细胞显示PLA2R和I类人类白细胞抗原（HLA）的表达量水平增加，包括HLA-A、HLA-B和HLA-F（图2E），表明通过MHC I类自身抗原呈递更活跃。PMN足细胞中的下调基因包含CRYAB和AIF1L，它们的下调与足突消失和PMN中的滤过屏障受损有关。

总的来说，分析结果揭示了PMN中足细胞特异行的标记物，并确定了BMP2是足细胞ECM产生和GBM增厚的潜在介导基因（图2）。

图2

3 体外和体内补体诱导的足细胞

  BMP2/pSMAD1/COL4信号传导

体外培养小鼠足细胞与BMP2重组蛋白进行孵育进行实验验证。在30分钟内，检测到了磷酸化的SMAD1（pSMAD1），这是典型的BMP2细胞内信使蛋白。在治疗后3小时，检测到Col4a3基因表达量显著增高，而Col4a4在孵育后1小时增加。其他Col IV同源物Col4a1、Col4a2和Col4a5在接受BMP2处理6小时后未显示上调。此外，与BMP2孵育24小时后，IV型胶原蛋白水平增加，并伴随强烈的SMAD1磷酸化。在来自前面单细胞转录组的PMN肾穿样本和其他PMN肾穿样本中，免疫荧光检测结果显示，在WT1（足细胞核标记物）阳性细胞周围BMP2表达升高，与WT1共定位的SMAD1磷酸化水平上调，GBM中Col IV水平增加。总的来说，这些结果验证了足细胞中BMP2/pSMAD1/COL4信号通路的体外和体内作用（图3）。

图3

补体沉积在PMN中很常见，并被认为是足细胞损伤的关键因素，因此作者对C3a和C5b-9两种补体对BMP2表达的影响进行了检测。将小鼠足细胞与C3a和C5b-9孵育24小时后 Bmp2 基因表达水平升高。然而，在治疗后48小时，足细胞裂解液中BMP2蛋白水平降低。电泳结果中17-kDa的BMP2蛋白条带代表着糖基化的可溶形式，考虑到孵育后BMP2 mRNA水平的增加，一个可能的解释是合成的BMP2被分泌到了细胞外。因此，作者测量了细胞培养基上清液中的BMP2蛋白水平，发现上清中BMP2蛋白水平升高，C3a和C5b-9均能诱导足细胞分泌BMP2。下游通路中，在C3a和C5b-9在刺激后48小时增加了SMAD1的磷酸化并增加了Col IV的表达。此外，特异性抑制剂DMH-1对BMP2的抑制阻断了SMAD1的磷酸化，并消除了C3a和C5b-9诱导的Col IV增加。我们对足细胞的研究阐明了PMN的两个主要病理变化，即免疫复合物沉积和GBM增厚之间的联系（图4）。

图4

4 PMN中M2巨噬细胞的激活

PMN是一种肾脏限定的自身免疫疾病，而髓系白细胞在自身免疫疾病中有重要的作用。将髓系细胞细分亚群，分为M2巨噬细胞、没有明显M1或M2分化的中间型巨噬细胞、TREM2+脂质相关巨噬细胞、增殖的巨噬细胞、CD14+经典单核细胞、CD16+非经典单核细胞、2型突状细胞（cDC2）、NEs和肥大细胞。PMN中M2巨噬细胞的比例明显较高，M2巨噬细胞标记物CD163的免疫组化染色结果证实了这一点。GSVA结果显示，在PMN中除非经典单核细胞和cDC2的大多数髓系细胞亚群中，基因转录、MHCII类抗原呈递、CD4+T细胞激活和有氧呼吸通路均有不同程度的激活。而在肥大细胞和增殖巨噬细胞中促进基质细胞增殖和ECM降解的功能受到了抑制。

在PMN肾脏中，M2样巨噬细胞表达与伤口愈合M2a、免疫调节M2b和免疫抑制M2c等巨噬细胞亚型相关的标记物CD86、CD163和MRC1。PMN样本显示APOC1和APOE的表达水平增加，这些基因与PMN的血脂异常有关。这些巨噬细胞表现出高水平的MHC II相关的蛋白，如HLA-DQA2、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DPA1和HLA-DQA1，表明增强了外源性抗原的处理和呈递，以激活白细胞。招募单核细胞的趋化因子CCL2和CCL8也在这些巨噬细胞中高表达。下调的基因包括促进M1极化的S100A9和炎症介质IL1B，表明这些巨噬细胞具有抗炎特性。此外，一些HSP基因，如DNAJB1和HSPA6，显示出明显的下调。

经典单核细胞分化为M2巨噬细胞的一个明显分支点是一群非极化的单核细胞。在PMN患者的极化过程中，初始状态下的细胞较少，而M2极化的细胞则更多，说明PMN中M2极化活跃。在极化后，在PMN中观察到炎性细胞因子IL1B的下调和C1qC、CCL2、MAF、CD163、MRC1和SELENOP的上调（图5）。

图5

5 PMN中B细胞的变化

对B细胞再次降维聚类，划分为原始B细胞、记忆B细胞和浆细胞。PMN样本显示出浆细胞比例升高，记忆B细胞比例的降低，暗示了B细胞的成熟和活化。此外，记忆B细胞和浆细胞中补体激活、吞噬作用和体液免疫等通路激活，但原始B细胞中未激活；而在PMN中，热休克蛋白、NOD途径、CD4+T细胞激活和TNF信号通路在所有B淋巴细胞中下调。

通过火山图和GO分析可以看出，记忆B细胞的HLA-DQA2抗原加工和呈递以及核糖体活性增强，浆细胞中IER2、JUNB和MEF2C的上调，细胞质翻译激活，说明抗体产生增强。尽管IER2上调的意义尚不清楚，但增强的JUNB和MEF2C可能参与了B细胞的发育和成熟（图6）。

6 PMN中T细胞的免疫抑制趋势

将T和NK细胞细分为CD4+ Th细胞、CD8+ CTLs、Foxp3+ Treg细胞、NK细胞和增殖T细胞。之前研究显示PMN患者外周血中的Treg百分比降低，而本次研究显示PMN肾脏中Treg细胞增加。PMN中，Th细胞和Treg细胞的上调基因有免疫抑制的作用。Th细胞和Treg细胞中CD52表达水平升高，这是在系统性红斑狼疮中下调的免疫抑制剂。EMP3在Treg细胞中增加，与胶质母细胞瘤中的免疫抑制和T细胞排斥有关。此外，这些细胞显示出各种HSP的明显下调，包括HSPA1A和HSP90AA1。GO富集分析显示Th细胞的T细胞激活通路活化，Treg细胞的T细胞受体结合通路活化，T和NK细胞中有氧呼吸和核糖体相关通路激活。因此，PMN中的Th细胞和Treg细胞可能发挥免疫抑制作用，上游机制有待进一步研究。PMN中有更多的细胞毒性T细胞，但这些细胞没有明显的差异基因（图6）。

图6

7 PMN中的细胞互作

通过细胞通讯分析，得到PMN和Ctrl中不同亚群的配体受体对信息。分析PMN和Ctrl之间表达差异显著的配体-受体在与PMN密切相关的五种细胞类型（Podo、G-Endo、M2样Mpa、Memory B和浆细胞）中的变化，发现浆细胞和M2样巨噬细胞与G-Endo、HRMC和多核单核吞噬细胞的PECAM1-PECAM1相互作用增加，表明免疫细胞黏附和激活增加。另一个上调的细胞互作是足细胞、记忆B细胞、浆细胞和M2样巨噬细胞的HLA-F到M2样巨噬细胞上的抑制性受体LIL1RB，这种相互作用可以抵抗巨噬细胞的吞噬。此外，M2巨噬细胞通过产生趋化因子CCL2、CCL3和CCL8与各种单核吞噬细胞进行沟通，以结合受体CCR1和CCR2，作为靶点，它们还从接收来自单核吞噬细胞的趋化因子CCL3和CCL8，以及来自T细胞和NK细胞的CCL5。经典和非经典单核细胞存在RETN- CAP1相互作用，以靶向足细胞、记忆B细胞、浆细胞和M2巨噬细胞。这种相互作用与代谢性疾病中的线粒体稳态受损，以及骨质疏松症中巨噬细胞增殖和破骨细胞活性有关，而其在PMN肾脏中的可能作用需要进一步的研究。下调的细胞通信涉及浆细胞来源的ICAM2与增殖T细胞上的整合素，以及各种免疫细胞和肾小球细胞来源的TGFB1与M2样巨噬细胞上的TGFBR1和TGFBR2。减少的ICAM2-整合素互作意味着白细胞粘附和相互作用减少，而下调的TGFB1-TGFBR交流则表明巨噬细胞不是PMN肾脏中的基质细胞（图7）。

图7

结论

补体组分触发PMN足细胞中BMP2表达升高，增加了足细胞中COL IV的表达，导致了GBM增厚。另外，在PMN中，M2a、M2b和M2c等M2巨噬细胞增加，表明这些细胞应该在PMN的发病机制中促进IgG的产生并调节补体系统。产生更多的IgG抗体的记忆B细胞和浆细胞肾脏浸润增加，伴随IgG表达增加。本次结果为PMN治疗提供了新的方向和靶点——抑制BMP2和浆细胞伤害的治疗。