目前树突状细胞(DC)疫苗作为一种可行的免疫疗法，其临床试验结果令人鼓舞。然而，DC疫苗的基因传递不足和抗原呈递以及细胞因子释放等方面的功能缺陷限制了其更广泛的临床应用。近日，中山大学的研究团队在Chemical Engineering Journal发表的题为A versatile gemini amphiphile-based platform with STING-activating properties for efficient gene delivery into dendritic cells的研究论文。团队开发了一系列阳离子双亲性(GA)分子，用于DC细胞的转染。数据表明团队开发的GA分子能通过形成简单的复合物将质粒DNA或mRNA稳定地转染到树突状细胞中，具有低载体/基因比、高装载效率和良好生物相容性的巨大优势，并论证GA分子具有STING通路激活作用，能增强DC的成熟和激活，并在后续DC的过继转移中诱导体内强烈的T细胞反应，从而抑制体内肿瘤的生长，展示出此类GA分子用于开发免疫细胞工程基因传递载体的强大潜力。本论文用到的报告基因EGFP(货号R1013)和mCherry(货号R1017) mRNA由APExBIO提供。

图1 免疫细胞工程GA分子文库的构建

1 GA分子文库设计合成

首先为了合成具有增强核酸络合能力所需的GA分子，作者通过组合设计方法构建了含有60个GAs分子的文库(图1A)。接着以EGFP-pDNA为报告基因，筛选所建立的GA分子文库，比较在相应的最佳GA条件下，表达的EGFP(图2B)的EGFP阳性细胞百分比(图2A)和细胞内平均荧光强度(MFI)。结果表明，在分子文库中排名前15位的候选GA分子的EGFP阳性细胞百分比高于商业转染试剂Lipo 2000。并通过将荧光素酶-pDNA作为报告基因的平行实验，进一步评估前15个候选GA的体外转染效率，荧光素酶活性分析显示，其中13个GAs的转染效率优于Lipo2000（图2C）。经过系统地研究GAs的亲水连接物对pDNA转染的影响，发现候选GA分子I2R3C18-1(图2E)的pDNA转染效率显著高于I2-1R3C18-1和I2-3R3C18-1，表明适当的亲水连接子长度对GA介导的pDNA转染至关重要。

图2 用于pDNA转染的GAs分子的体外筛选

2 基于GA的二元复合物能有效将pDNA转染到免疫细胞

经过上述筛选实验，作者选择I2R3C18-1作为具有代表性的高效免疫细胞转染的载体。首先对pDNA/I2R3C18-1二元配合物的理化参数进行表征。结果表明pDNA/I2R3C18-1二元配合物的粒径合适(244 nm)，尺寸分布均匀(PDI=0.04)，表面正电荷较弱(~5.7mV)(图2F)，具备良好的pDNA结合能力(图2G)以及生物相容性(图2H)。通过对pDNA与内/溶酶体的共定位研究pDNA/I2R3C18-1二元复合物的内/溶酶体逃逸能力。孵育4h后，在细胞内观察到pDNA的绿色信号，很少与内/溶酶体（红色）重叠(图2J-K)。进一步探究I2R3C18-1对于难转染的免疫细胞类型发现，I2R3C18-1相比商业试剂Lipo2000，可以显著增强pDNA转染两种主要的抗原提呈细胞的效率，包括小鼠巨噬细胞(RAW 264.7细胞，图2L)和小鼠树突状细胞(DC 2.4细胞，图2M)。说明I2R3C18-1是将pDNA转染到免疫细胞中的最佳候选GA分子。

图2 用于pDNA转染的GAs分子的体外筛选

3 基于GA的二元复合物能有效将mRNA转染到免疫细胞

作者接下来评估GA的二元复合物对于mRNA的递送性能，以EGFP-mRNA作为报告基因转染DC 2.4细胞进行体外筛选，最终选出I2R2C18-2作为最好的GA候选分子，用其装载的EGFP-mRNA阳性百分比为96.2%，比Lipo 2000具有更强的转染能力(图3C)。对mRNA/I2R3C18-2二元配合物的理化参数如粒径、PDI以及带电荷等进行表征，以及mRNA结合能力和生物相容性验证均表明I2R2C18-2具备良好的mRNA递送能力。

基于上述结果，作者将I2R3C18-2用于两种最难转染的原代免疫细胞BMDCs和BMDMs验证其转染效率。结果显示mRNA转染后，BMDCs和BMDMs均显示出强烈的EGFP信号，BMDCs的转染效率为37.3 %，BMDMs的转染效率为83.0 %，分别是Lipo 2000处理的1.6倍和1.3倍(图3H-I)。上述结果表明I2R2C18-2在免疫细胞类型中具有强大的mRNA递送能力。

图3 用于mRNA转染的GAs分子的体外筛选

4 mRNA/GA二元复合物能显著诱导BMDCs的STING激活

树突状细胞是最重要的抗原呈递细胞之一，成熟的树突状细胞通过呈现抗原来激活T细胞以消除感染或癌细胞。作者接下来通过递送OVA-mRNA来论证I2R2C18-2是否有潜力对树突状细胞进行基因修饰而设计成为过继转移疫苗。免疫印迹检测显示OVA-mRNA/I2R2C18-2二元复合物转染后产生大量OVA抗原蛋白(图4A)。然后作者使用SIINFEKL-H-2 Kb特异性抗体对骨髓来源树突状细胞(BMDCs)进行染色评估其肽表位呈递情况，证明OVA-mRNA/I2R2C18-2二元复合物能够促进OVA衍生的SIINFEKL肽的呈递(图4B)。流式细胞术分析显示，OVA-mRNA/I2R2C18-2二元复合物孵育导致CD11c+ BMDCs上CD80和CD86高表达，与脂多糖(LPS)处理相当，表明BMDCs成熟良好(图4C-D)。

接下来，作者通过分析炎症基因的表达来检测免疫激活。与LPS相比，I2R2C18-2和OVA-mRNA/I2R2C18-2二元复合物处理后，与STING通路激活相关的Ifnb和Cxcl10的基因表达显著升高（图4E-F），并诱导广泛的IFN-β蛋白表达(图4G)。表明基于I2R2C18-2的载体具有内在的STING介导的免疫激活活性。另外，cGAMP是最有效的STING激动剂之一，可以诱导DC激活，并增强T细胞反应。作者接着探究将cGAMP纳入OVA-mRNA/I2R2C18-2二元复合物中，形成的cGAMP/OVA-mRNA/I2R2C18-2三元配合物是否能介导更密集的DC成熟。结果表明，cGAMP/OVAmRNA/I2R2C18-2三元复合物能更显著提高Ifnb和Cxcl10基因的表达(图4I-J)，在cGAMP/OVA-mRNA/ I2R2C18-2三元复合物处理的细胞中，IFN-β蛋白含量在48 h内保持在高水平(图4K)。综上所述，I2R2C18-2复合物内在的STING激活特性和高效的mRNA递送能导致有效的抗原呈递和DC成熟，有利于过继细胞治疗的基因工程DC疫苗的制造(图4L)。

图4 BMDCs的成熟和激活

5 基于GA的四元复合物进一步改善了对免疫细胞的mRNA转染

可电离的阳离子类脂材料可配制成LNPs，以提高体内外mRNA传递效率。作者接着探究GA是否可以与mRNA、DOPE、DMG-PEG和胆固醇构建类似LNP的四元复合物，进一步改善mRNA对免疫细胞的转染。经过系列筛选实验，含有I1和R1反应物的GAs在形成LNP样四元复合物后表现出强大的mRNA传递特性(图5F)，并确定了最好的候选GA分子I1R1C18-2，其制备的四元复合物的荧光素酶活性比商业试剂Lipo 2000高6.9倍，反而是基于I1R1C18-2的二元复合物几乎没有将mRNA转染到细胞中(图3A-B)。并且基于I1R1C18-2的四相配合物粒径更小(59 nm)，PDI更小(0.14)以及更接近中性电荷(图5G)，I1R1C18-2的IC50也比I2R2C18-2高3倍，表明mRNA转染的载体更安全(图5I)。综上所述，以上数据为使用GA形成LNP样四元复合物提供了额外线索，使mRNA能够有效地转染到免疫细胞中。

图5 基于GA的四元复合物的配方和优化

6 基因工程DC细胞的体内抗肿瘤疗效

最后，作者在B16F10-OVA同种异体移植肿瘤模型中评估基于I2R2C18-2的二元或三元复合物处理的基因工程DC细胞的体内治疗效果。免疫治疗后第15天从小鼠身上切除肿瘤，进行流式细胞术分析T细胞群。经过OVA-mRNA/I2R2C18-2和cGAMP/OVA-mRNA/I2R2C18-2处理的DC细胞过继治疗后肿瘤组织中CD8 + T细胞浸润显著高于PBS对照组和仅用OVA-mRNA处理的DC(图6B)，进一步分析CD8+ IFN-γ+ T细胞(图6C)和CD8+ TNF-α+ T细胞(图6D)显示类似的结果，表明基于I2R2C18-2的二元或三元复合物处理后使T细胞反应更强烈。作者比较使用不同DC组治疗方法后的肿瘤体积，发现仅用OVA-mRNA处理的DC组的肿瘤体积与对照组相比没有显著差异。然而，与对照组和仅OVA-mRNA组相比，OVA-mRNA/ I2R2C18-2组极大地抑制了肿瘤生长。并且cGAMP/OVA mRNA/I2R2C18-2组表现出最显著的肿瘤生长抑制，在33天内肿瘤体积保持在非常低的水平(图6F)。到第48天终点，OVAmRNA/I2R2C18-2和cGAMP/OVA-mRNA/I2R2C18-2组的小鼠生存率分别为20 %和80% (图6G)。相比之下，对照组和仅用OVA-mRNA组处理的所有小鼠均在第33天死亡。综上所述，经OVA-mRNA/I2R2C18-2或cGAMP/OVA-mRNA/ I2R2C18-2处理后成熟的BMDCs的过继转移表现出强烈的T细胞反应，并有效抑制肿瘤生长。证明基于GA分子进行体外基因工程改造DC细胞的优势，达到了理想的治疗效果，并减少与药物传递系统相关的体内脱靶毒性。

图6 基因工程DC疫苗的过继转移引起了强烈的T细胞反应并抑制了肿瘤的生长

结论

本文作者构建系列GAs阳离子两亲性分子文库用于非病毒载体开发，能有效地将pDNA或mRNA传递到难以转染的免疫细胞中进行体外基因修饰。GA候选分子可以形成二元、三元甚至四元复合物将抗原编码的mRNA传递到树突状细胞，使抗原表达和呈递能力增强，并通过细胞内STING信号通路促进树突状细胞的活化，引起强烈的T细胞反应和抗肿瘤作用，有利的支持了基因工程DC疫苗的研究思路。