在当今生物医学研究的前沿，环状RNA（circRNA）因其在多种生物功能和疾病中的重要作用而备受关注。特别是在癌症研究中，circRNA的表达水平显著降低，表明其具有肿瘤抑制潜力。然而，现有的促进circRNA生成的方法有限，亟需新的策略来提高circRNA的表达水平。为了解决这一问题，近日中南大学湘雅药学院研究团队在《Nucleic Acids Res》（IF=16.97）上发表了题为“Invention of circRNA promoting RNA to specifically promote circRNA production”的突破性研究文章，介绍了一种新颖的促进circRNA生成的方法，称为circRNA促进RNA（cpRNA），并展示了其在癌症治疗中的巨大潜力。APExBIO团队为本文的实验研究提供了高品质的链霉亲和素磁珠产品：Streptavidin Beads T3 (Cat. No：K1301)

文章图形摘要

Fig 1 circRNA合成路线图

研究背景

circRNA是一类具有闭合环状结构的内源性RNA分子，与线性RNA相比，它们缺乏5'帽子和3'聚腺苷酸尾巴，对核酸酶具有高抗性，因而具有更长的寿命。circRNA参与多种生物学过程，包括作为miRNA海绵、调节转录或剪接、与蛋白质相互作用，甚至可能编码蛋白质。circRNA在多种疾病中发挥作用，特别是在癌症中，circRNA的表达失调与肿瘤的发生、进展、侵袭和转移密切相关。

目前促进circRNA生成的方法有限，主要包括构建含有外显子序列的载体以过表达circRNA，以及使用CRISPR基因编辑工具或体外合成circRNA。这些方法存在效率低下、成本高、可能引起免疫反应等问题。同时鉴于circRNA在疾病中的重要作用，特别是其在癌症中的潜在治疗价值，开发新的方法来增加抗癌circRNA的表达水平是一个迫切需要解决的临床问题。

文章提出了一种新的方法，即通过设计circRNA促进RNA（cpRNA），来补充现有的促进circRNA生成的方法。cpRNA旨在通过与pre-mRNA中的RCMs互补配对，增强circRNA的形成。以探索cpRNA作为一种新型策略，用于特异性增加内源性circRNAs的产生，并通过调节circRNA相关的途径来抑制癌细胞的增殖和迁移，展示其治疗潜力。

研究工作

PART/1

构建和评估新型circRNA调控工具：通过共转染split-GFP报告质粒和cpRNA，使用半定量RT-PCR、共聚焦显微镜、WB和生物素Pull-down实验验证cpRNA的促进作用。

Fig 2 设计的cpRNA促进circfp的产生

PART/2

cpRNA优化：通过改变cpRNA的中间间隔基团、结合位点长度、与RCMs的距离等因素，优化cpRNA的设计

Fig 3 cpRNA的优化

PART/3

cpRNA促进内源性circRNAs生物合成：使用特定的cpRNAs转染细胞，通过实时PCR和Sanger测序验证cpRNA对内源性circRNAs（如circZKSCAN1和circSMARCA5）表达的促进作用。

Fig 4 cpRNA对内源性circRNA产生的生物发生的影响

PART/4

cpRNA抑制HCC细胞增殖和迁移：通过CCK-8、克隆形成和创伤愈合实验，评估cpRNA对HCC细胞增殖和迁移的影响。

Fig 5 CpRNA抑制HCC细胞的增殖和迁移

PART/5  

cpRNA调控circRNA相关途径：通过生物信息学分析、RNA沉淀和荧光素酶报告基因分析，研究cpRNA如何通过调控circRNA相关的miRNA和mRNA来影响细胞功能。

Fig 6 CpRNA调节环状rna的下游通路

PART/6

cpRNA部分通过拮抗DHX9解旋功能促进circRNA生物合成：通过过表达和敲低DHX9的实验，探讨cpRNA促进circRNA生成是否部分通过拮抗DHX9的解旋功能。

Fig 7 CpRNA以dhx9依赖性的方式促进circfp的生物发生

研究结论

本研究开发了一种新型的cpRNA，能够显著促进circRNA的生成，特别是对含有RCMs的circRNA。cpRNA通过拮抗DHX9的解旋功能，部分实现了其促进作用。与现有的circRNA过表达方法相比，cpRNA设计更简单、成本更低，并且减少了线性转录本的干扰。尽管cpRNA策略存在一定的局限性，但其在癌症等疾病治疗中的潜力不容忽视。

文章精彩看点

• cpRNA的设计：提出了一种新的策略，通过设计cpRNA与RCMs侧翼序列互补配对，促进circRNA的生成。
• 靶向调控：cpRNA能够特异性地增强含有RCMs的circRNAs的表达，为研究circRNA的功能和治疗潜力提供了新工具。

不足之处（文中）

• 特异性限制：cpRNA策略主要针对含有RCMs的circRNAs，这限制了其应用范围。
• 非特异性问题：cpRNA可能促进同一基因来源的多个circRNAs的表达，导致非特异性产物的产生。
• 递送效率和精确性：核酸递送的效率和精确性仍是基因治疗领域面临的挑战。

后续可展开角度

1. 提高cpRNA的特异性：研究如何提高cpRNA的特异性，减少非目标circRNAs的产生。

2. 优化递送系统：探索更高效的核酸递送方法，提高cpRNA的细胞内稳定性和作用效率。

3. 扩展应用范围：研究cpRNA在其他疾病模型中的应用，以及在临床治疗中的潜力。

4. 机制研究：深入研究cpRNA促进circRNA生成的分子机制，以及其在调控细胞功能中的作用。

参考文献

[1] He Z, et al. Invention of circRNA promoting RNA to specifically promote circRNA production. Nucleic Acids Res. 2024 Aug 9: gkae693. doi: 10.1093/nar/gkae693. PMID: 39119897.