解码mRNA药物：从原理到应用，开启未来治疗新篇章

mRNA作为药物的优势在于，通过工程化的方法，可以灵活地调节其结构和功能，从而满足不同的治疗需求。为确保药效和安全性，必须充分考虑和优化mRNA的翻译效率和稳定性。此外，通过结合不同的mRNA结构元素，研究人员还可以调节和优化mRNA药物的药代动力学特性，包括蛋白质表达水平和持续时间。本文将阐述抗原编码mRNA的药理学原理、体外转录mRNA的主要结构元素，以及调控mRNA翻译效率和稳定性的策略。此外，还将讨论基因编辑工具如CRISPR-Cas9在T细胞疗法中的应用。

一. 抗原编码mRNA的药理学原理

具有抗原编码序列的线性化DNA质粒模板用于体外转录。体外转录的mRNA包含帽子、5′和3′非翻译区(untranslated regions, UTRs)、开放阅读框（open reading frame, ORF）和多聚腺苷酸尾（poly(A) 尾）。这些结构决定了mRNA分子转入细胞后的翻译活性和稳定性。一部分逃过了核糖核酸酶降解的外源mRNA，通过细胞特异性机制自发内吞，进入内体途径。当mRNA进入细胞质后，它就会利用宿主细胞的蛋白质合成机制进行翻译。mRNA与核糖体、真核翻译起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor, eIF4E)和真核翻译起始因子4G(eukaryotic translation initiation factor, eIF4G)以及poly(A)尾结合蛋白结合，形成环状结构并进行活性翻译。

在外切核酸酶的催化下，mRNA会通过降解终止翻译。mRNA帽子会被解帽酶DCP1、DCP2和DCPS32水解，然后残余的mRNA被5ʹ-3ʹ外切核酸酶1(XRN1)消化。如果mRNA被沉默并存在于细胞质加工体中，降解可能会延迟。另外，外泌体中的mRNA也可能发生核内分解。其他各种机制也可控制异体mRNA（例如，带有过早终止密码子的mRNA）的分解。

图1：抗原编码mRNA的药理学原理（参考来源：Sahin U et al./Nature reviews Drug discovery）

翻译后的蛋白质产物经过翻译后修饰，其性质取决于宿主细胞的特性。这些蛋白质产物可以在产生它们的细胞中发挥作用，或者被分泌，通过自分泌、旁分泌或内分泌机制发挥作用。

二. 四种IVT mRNA的结构和遗传信息表达的机制

四种体外转录（IVT） mRNA分别为常规mRNA、自增殖mRNA、转增殖mRNA和环状mRNA。它们的共同特点是都包含一个5′帽子、5′和3′非翻译区、一个开放阅读框和一个poly(A)尾巴。它们的区别在于它们的开放阅读框中是否包含能够自我复制或放大的基因，以及它们是否形成一个闭合的环状结构。这些不同的结构决定了它们在细胞内的稳定性、翻译效率和免疫原性。

表1 四种IVT mRNA 的特点

这几种体外转录mRNA均可用于癌症治疗，通过编码肿瘤抑制因子、肿瘤抗原、细胞因子、基因编辑蛋白或嵌合抗原受体等功能蛋白。

图2 四种体外转录的mRNA的结构和在细胞内的工作机制（参考来源：Liu C et al./ Nature Reviews Cancer）

常规mRNA主要通过体外转录从环状质粒DNA（plasmid DNA, pDNA）中获得，并通过核糖体翻译获得蛋白质。pDNA在无细胞系统中通过限制酶线性化，随后通过 PCR 扩增。DNA 模板包含 T7、T3 或 SP6 启动子序列、5′ 非翻译区（UTR）序列、开放阅读框（ORF）序列、3′ UTR 序列和聚（A）尾序列。体外转录过程所需的主要材料是核苷酸、5′帽类似物、各种酶（如 T7 转录酶、加帽酶等）和缓冲液。

三. 抗原编码mRNA的免疫治疗

为了对mRNA进行免疫治疗，蛋白质产品需要降解成抗原肽表位。这些肽表位被加载到主要组织相容性复合体（MHC）分子上，确保这些抗原在免疫效应细胞表面递呈。细胞质蛋白质会被蛋白酶体降解，并被输送到内质网，在那里被装载到MHC I类分子上，递呈给CD8+细胞毒性T淋巴细胞。几乎所有细胞都表达MHC I类分子。在抗原递呈细胞中，为了获得同源T细胞的帮助以产生更强、更持久的免疫反应，蛋白质产物需要被输送到MHC II类装载区。这可以通过在mRNA中加入路由信号编码序列来实现。此外，树突状细胞吸收的外源抗原也可通过一种被称为交叉刺激（cross-priming）的机制进行处理并加载到MHC I类分子上。蛋白质衍生的表位可通过MHC I类和MHC II类分子递呈在细胞表面。

图3 IVT mRNA的主要结构元素及调控mRNA的翻译效率和稳定性的策略（参考来源：Sahin U et al./Nature reviews Drug discovery）

IVT mRNA可调节的结构元素，包括5’端帽、5’和3’ UTRs、编码区和poly(A)尾，及对应的修饰方法，如使用不同类型的帽类似物、引入调节序列元素、优化密码子使用、使用修饰核苷酸等。相比于原始的mRNA，使用修饰的mRNA可以产生更高和更持久的蛋白质信号。通过对IVT mRNA进行精细的结构设计，可以调节和优化mRNA药物的药代动力学特性，从而实现不同的治疗目的。

四. 基因编辑工具——CRISPR-Cas9及其递送

CRISPR-Cas9是一种高效的基因编辑工具，由Cas9内切酶和单向导RNA组成。与传统的癌症疗法相比，CRISPR-Cas9疗法可以永久性地破坏癌细胞的存活基因，避免多次重复给药治疗，提高疗效。将Cas9和单向导 RNA（single-guide RNA, sgRNA）这两种成分成功送入靶细胞是治疗成功的关键。

目前，有三种主要的递送方法：直接递送Cas9蛋白、以DNA形式递送Cas9和以mRNA形式递送Cas9。直接递送Cas9蛋白是最直接的方法，但会引起不良的体液和细胞免疫反应，且Cas9蛋白较大，使得病毒和非病毒递送具有挑战性。以DNA形式递送Cas9常用质粒和腺相关病毒作为载体，但会产生较高的脱靶效应。

最近，体外转录的mRNA被用作Cas9的瞬时递送形式，可大大降低潜在的脱靶效应和细胞核内的遗传毒性，实现高效的基因编辑。然而，大多数装载了cas9 mRNA的载体主要在肝细胞中显示出疗效，而在非肝组织中的传递是一个尚未实现的主要目标。

用脂质纳米颗粒封装的Cas9 mRNA和sgRNA转染癌细胞或T细胞。mRNA在细胞质中翻译，产生CRISPR相关蛋白-Cas9蛋白，然后与纳米颗粒中逸出的sgRNA复合，形成对特定DNA序列具有亲和力的核糖核蛋白。当这种情况发生在癌细胞中时，核糖体复合物就会转移到细胞核中，从而完成对肿瘤存活基因的破坏。在T细胞中，这可以实现敲除编码程序性细胞死亡1（PD1）或内源性T细胞受体（T cell receptor, TCR）的基因，从而诱导肿瘤细胞凋亡。

图 4 编码用于癌症基因组编辑的 Cas9 mRNA（参考来源：Liu C et al./Nature Reviews Cancer）

五、编码CAR/TCR的mRNA在T细胞疗法中的应用

mRNA编码的嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）或T细胞受体 (T cell receptor, TCR)具有表达短暂、转染高效、整合低风险和剂量可控等优点。通常，TCR或CAR通过逆转录病毒或慢病毒基因转入自体或异体T细胞，但这种病毒转导方式会使受体细胞面临基因突变的风险。因此，编码CAR或TCR的mRNA的一大优势为转染率高且对核基因无毒。例如，mRNA CAR的电穿孔被广泛用作病毒转染的新型替代方法，这种方法可使CARs在T细胞表面瞬时表达约1周，同时避免可能出现的针对CARs的免疫反应。

虽然编码CAR或TCR的mRNA表达时间有限（约1周），但改变mRNA的结构可有效延长CAR或TCR的表达时间，从而减少重复注射的需要。早期临床前研究表明，经mRNA转染的编码CAR或TCR的T细胞可有效对抗表达相应抗原的癌细胞。

虽然基于mRNA 的CAR T或TCR T细胞体外工程具有在T细胞表面产生高水平编码CAR /TCR的优势，但由此产生的工程T细胞是个体化的细胞治疗产品，必须从患者体内提取T 细胞，且制造过程成本高、耗时长。为了克服这些挑战，可以静脉注射编码CAR/TCR的T 细胞靶向mRNA纳米颗粒，从而在体内生成CAR/TCR工程T细胞。

图5 用于T细胞工程的体外和体内递送CAR和TCR的mRNA（参考来源：Liu C et al./Nature Reviews Cancer）

（a.体外转染编码CAR和TCR的mRNA以进行T细胞修饰。首先从患者的血液中分离出T细胞，在组织培养物中扩增并用mRNA纳米粒子转染。然后mRNA在细胞质中翻译，生成TCR或CAR并特异性地呈现给肿瘤细胞。然后它可以与肿瘤细胞结合并诱导肿瘤细胞死亡。b. T细胞靶向mRNA-脂质纳米粒子促进人T细胞体内产生CAR/TCR。患者接种T细胞靶向抗体（例如抗CD5抗体）—功能化mRNA—脂质纳米颗粒，通过胞吞作用进入循环T细胞。编码CAR/TCR的mRNA在细胞质中翻译，以驱动T细胞中的CAR/TCR表达。）

表2 三种mRNA转染T细胞的技术

小结

IVT mRNA可调节的结构元素包括5’端帽、5’和3’ UTRs、编码区和poly(A)尾，及对应的修饰方法，如使用不同类型的帽类似物、引入调节序列元素、优化密码子使用、使用修饰核苷酸等。相比于原始的mRNA，使用修饰的mRNA可以产生更高和更持久的蛋白质信号。通过对IVT mRNA进行精细的结构设计，可以调节和优化mRNA药物的药代动力学特性，从而实现不同的治疗目的。此外，在癌症治疗领域，由mRNA编码的蛋白产物可以在产生它们的细胞中发挥作用，或者被分泌，通过自分泌、旁分泌或内分泌机制发挥作用。

参考文献

Sahin U, Karikó K, Türeci Ö. mRNA-based therapeutics—developing a new class of drugs[J]. Nature reviews Drug discovery, 2014, 13(10): 759-780.

Liu C, Shi Q, Huang X, et al. mRNA-based cancer therapeutics[J]. Nature Reviews Cancer, 2023: 1-18.