研究背景

糖尿病肾病（DKD）是糖尿病中慢性微血管化最危险的并发症之一，其中上皮-间充质转化（EMT）被广泛认为是DKD的关键因素。EMT的特征包括上皮细胞极性和细胞-细胞粘附丧失，以及获得间充质样表型。而且高水平的乳酸已被报道会增加DKD病情进展的风险，但关于乳酸如何影响EMT从而驱动DKD进展的潜在机制目前还不清楚。

近日，来自中国医科大学的研究团队发表的题为Lactate drives epithelial-mesenchymal transition in diabetic kidney disease via the H3K14la/KLF5 pathway的研究论文，作者团队发现乳酸能增加DKD中组蛋白H3赖氨酸14乳酸化（H3K14la）的水平，从而促进KLF5的表达参与EMT过程。通过特异性敲低或药理抑制KLF5可减少EMT的发展和减轻DKD纤维化。这一研究结果可以更好地理解DKD发病机制，并通过靶向乳酸驱动的H3K14la/KLF5通路为DKD提供新的治疗策略。论文中总RNA提取用到的Trizol试剂（货号K1621）由APExBIO提供。

研究结果

01 肾乳酸水平与肾功能不全呈正相关

作者首先验证肾乳酸水平是否与DKD的进展相关，采用肾乳酸与肾功能指标进行相关性分析。发现在db/db小鼠（Ⅱ型糖尿病小鼠模型）中，肾乳酸水平与24 h ALB（尿蛋白）、Scr、BUN（图1A-C）以及肾促纤维化因子（acta2、snail1、slug和twist1）水平呈强正相关，但与cdh1（编码e-钙粘蛋白）呈负相关（图1D-H），提示肾乳酸水平与肾功能不全呈正相关。

图1 db/db小鼠肾乳酸水平与肾功能不全呈正相关

02 乳酸水平的改变影响DKD小鼠的EMT

已知EMT的发生会极大地促进肾纤维化的进展，作者接着向db/db小鼠给予乳酸或使用乳酸乙酯处理以研究是否能加速EMT和DKD纤维化。数据显示，乳酸和乳酸乙酯处理后显著增加了db/db小鼠肾乳酸的产生（图2B），与db/db组相比，乳酸组明显提高了Glu、BUN、Scr和24小时尿蛋白水平（图2C-F）。免疫荧光染色也显示给予乳酸能显著降低db/db小鼠中e-钙粘蛋白（上皮细胞标志物）的表达，以及增加α-SMA（间充质标志物）的表达（图2L-N），表明过量的乳酸生产增加了db/db小鼠的EMT进展。Masson毛状体染色（图2O-P）显示，乳酸水平的升高显著促进了肾小管纤维化。这些数据表明乳酸水平的升高会显著促进EMT的进展和肾纤维化。

图2 补充乳酸可促进db/db小鼠的EMT

反之，作者继续探究降低乳酸水平能否改善EMT和DKD纤维化。乳酸脱氢酶A（LDHA）是乳酸生成的关键酶，作者将LDHA抑制剂肟酸钠（Ox）用于db/db小鼠以降低肾乳酸的产生（图3B）。有趣的是，Ox处理的db/db小鼠的Glu、BUN、Scr和24h尿蛋白水平均低于对照组（图3C-F）。进一步测定体内外EMT相关蛋白水平显示，与db/db小鼠组相比，Ox处理导致e-钙粘蛋白和ZO-1的表达升高，同时α-SMA和Vimentin的表达较低（图3G-K）。免疫荧光染色结果显示，与对照组相比，db/db小鼠中e-钙粘蛋白和α-SMA的表达也有类似的结果（图3L-N）。Masson的毛状体染色也表明db/db小鼠在给药后肾小管纤维化减少（图3O-P）。结果表明抑制乳酸的产生可以有效抑制db/db小鼠的EMT，减轻DKD纤维化，改善db/db小鼠的肾功能损害。

图3 LDHA抑制剂（草肟酸钠，Ox）可减弱db/db小鼠的EMT

03 乳酸调节组蛋白H3赖氨酸14（H3K14）的乳酸化

乳酸是组蛋白乳酸化的前体，作者假设组蛋白乳酸化可能在DKD中发生改变。组蛋白的western印迹分析显示，与正常对照（db/m小鼠）肾脏相比，db/db小鼠肾脏中泛赖氨酸乳酸化（Pan kla）水平显著升高，并且主要是组蛋白H3的赖氨酸乳酸化（图4A-B）。随后，通过蛋白印迹法检测H3不同赖氨酸残基（H3K18la、H3K14la、H3K9la、H3K23la、H3K27la、H3K14ac）的乳酸化水平，结果显示与其他乳酸化水平相比，模型组（AEG）H3K14la的表达显著升高（图D-E）。随后对Pan kla和H3K14la的荧光检测也证明其蛋白表达明显升高（图4F-H）。所有这些发现都支持乳酸促进DKD中组蛋白H3K14的乳酸化。

图4 模型小鼠的组蛋白乳酸作用增加

04 H3K14la介导KLF5上调并在EMT过程中抑制cdh1转录

组蛋白修饰会影响靶基因的转录激活和抑制。为了探讨H3K14la在EMT中的潜在功能意义，作者采用RNA-seq和ChIP-seq分析来确定受H3K14la调控的候选基因。比较对照组和模型组发现有47个基因上调（图5C）。PCR分析进一步证实KLF5、serpine1和dclk2基因在模型组中表达显著升高（图5D-F）。为了确认这些基因是否能有效地影响DKD中的EMT，作者使用siRNA敲低的KLF5, serpine1和dclk2的HK-2细胞进行实验，免疫印迹结果证实了KLF5的敲低有效地减弱了EMT的进展（图5H-I）。因此作者选择KLF5作为H3K14la修饰的候选靶基因。

作者接着探讨KLF5是否会抑制cdh1表达而对EMT过程产生影响。在HK-2细胞中使用双荧光素酶报告基因评估KLF5对cdh1启动子活性的影响，过表达KLF5强烈抑制了HK-2细胞中cdh1启动子的活性。而当cdh1突变时，抑制作用被消除（图5K）。在KLF5敲低HK-2细胞中cdh1启动子活性抑制被逆转（图5L）。这些结果表明KLF5是HK-2细胞中cdh1转录的有效抑制因子。

图5 H3K14la修饰介导KLF5表达上调并抑制cdh1转录

05 肾脏中KLF5的敲低可改善

    DKD中的EMT进展

为了进一步阐明KLF5在DKD EMT进展中的作用，作者构建了肾KLF5敲低（KLF5-KO）的db/db小鼠模型。数据证明与db/db组相比，KLF5基因敲低组的BUN、Scr和24h尿蛋白水平降低，血糖水平未见变化（图6B-E），而且KLF5基因敲低导致e-钙粘蛋白和ZO-1的表达增加，而α-SMA和Vimentin的表达降低（图6F-J）。免疫荧光染色显示，在KLF5敲低组中，e-钙粘蛋白和α-SMA的表达呈相似的趋势（图6K-M）。Masson三色和天狼星红染色显示，KLF5基因下调显著降低了db/db小鼠肾小管纤维化和胶原沉积（图6N-P）。这些结果表明，抑制KLF5可以有效改善DKD的EMT进展。

图6 敲除klf5可改善db/db小鼠的EMT

06 KLF5的药理抑制可减轻EMT，

    减少DKD的进展

最后作者为了探究药物抑制KLF5是否也能对DKD有保护作用，对db/db小鼠中每天腹腔注射KLF5抑制剂（ML264）（图7A），然后对肾脏进行DKD相关的病理分析。持续给药6周后肾内KLF5的表达显著降低（图7B-C）。与db/db小鼠相比，ML264治疗小鼠的肾功能相关Scr、BUN和24h尿蛋白显著改善，但对体重和Glu水平没有影响（图7D-H）。Westernblot数据显示，ML264明显抑制e-钙粘蛋白和ZO-1的表达减少，减轻α-SMA和波形蛋白的表达（图7I-M）。同样，免疫荧光染色显示ML264治疗组中钙粘蛋白明显升高，α-SMA水平降低（图7N-O）。此外，通过Masson毛状体和天狼星红染色，ML264可显著抑制肾小管纤维化面积和胶原沉积（图7P）。总之，这些结果表明，中断KLF5的表达是缓解DKD中EMT的一种潜在策略。

图7 KLF5的药理抑制作用降低了db/db小鼠的EMT

结论

本研究显示乳酸水平与DKD纤维化水平呈正相关，并首次证明了乳酸可诱导H3K14la，激活KLF5的表达，抑制cdh1转录来促进EMT，论证了肾脏特异性敲低KLF5可以抑制EMT的发展并改善肾纤维化。阐明乳酸在促进肾功能不全和DKD纤维化恶化中的生物学功能，为DKD的代谢-表观遗传学的理解提供一个重要的补充。