miRNA功能研究思路梳理——从头到尾，一步没落

在各种组学技术轰轰烈烈地被用于研究的同时，还是有非常多的基础研究也一直在默默的开展着，基础研究一直以其踏实稳重的形象带给我们一个个研究惊喜。今天，小编将目光锁定在miRNA的功能研究方面，让我们一起来看看如何解析这个短小的非编码RNA在机体里的功能吧！

一、miRNA简介

miRNA是一类由内源基因编码的长度19-25nt的非编码单链RNA分子，在动植物中参与转录后的基因表达调控。动物中miRNA的生物合成比较清晰，miRNA基因在细胞内会进行复制和转录。转录时先形成长度为300-1000个碱基的miRNA的初级转录产物pri-miRNA。pri-miRNA经Drosha酶切割成长度为70-90nt的发夹结构前体miRNA，称为pre-miRNA，此时并不成熟的miRNA，需要在细胞质中进一步加工才能成为成熟且有功能的miRNA。在动物细胞中一般是由运转蛋白Exportin -5，将不成熟的由细胞核内转移到细胞质中，并在Dicer酶的作用下进一步切割形成长度是19-25nt的成熟miRNA。成熟的miRNA与其它蛋白一起形成RNA诱导沉默复合体（RISC），行使靶向RNA的降解或者是翻译抑制作用。

图1 miRNA的合成及功能图例

二、miRNA的作用机制

在动物中，miRNA的作用机制主要有两种，第一是miRNA通过自身的“种子序列”与mRNA的3’UTR区域互补配对结合，从而导致mRNA的翻译被抑制，从而影响基因的表达。第二是可以在翻译延伸阶段阻止核糖体的前进，导致翻译的终止。正是因为miRNA会影响mRNA的表达和翻译，所以会涉及到相应的表型变化，而这也恰恰是我们研究miRNA的最大目的所在——看其影响的靶基因是谁，看最终导致的表型变化是什么。所以预测和验证miRNA的靶基因在该领域的研究中占据重要地位。

三、miRNA靶基因预测数据库

一般miRNA数据库都可以得到miRNA以及其靶基因的详细信息，这里我们以miRDB（https://mirdb.org/）为例做介绍，这个数据库用起来比较简单，我们可以通过miRNA寻找其靶基因，也可以通过靶基因寻找其对应的miRNA。如下图是我们以hsa-miR-222-5p为检索对象，得到其靶基因列表后我们随机选择GNA12这个靶基因的具体信息展开的结果。可以看到，这里面包含miRNA和靶基因的具体信息，以及两者结合的位点信息等。

图2 miRNA靶基因预测结果

除了miRDB外，TargetScan（https://www.targetscan.org/vert_80/）；Starbase（https://rnasysu.com/encori/index.php）；miRBase（https://mirbase.org/）也都可以进行miRNA的靶基因预测。

四、miRNA的研究思路

要开展miRNA的研究，一般我们会从下面几个角度去考虑。

1.确定要研究的miRNA

既然要开展miRNA的研究，那我们首先需要有miRNA才可以。这个miRNA怎么找呢？我们可以从几个方面考虑，首先，如果我们前期做过miRNA-seq或者miRNA芯片的话，那我们可以从其中寻找在对立组的样本中有差异的miRNA进行研究，当然测序或者芯片得到的这种差异需要经过qPCR验证后才可以进行后续的工作，这个验证除了保证数据完整外，更为后续所有工作鉴定坚实的基础，不要说后续做了一大半了，发现这个差异是假的，那就很糟糕了。举例说，如果前期做过癌症组织和癌旁组织的miRNA-seq，那我们可以选择有差异的miRNA继续后续的深入研究。当然除了我们自己做前期的测序或者芯片外，我们也可以从数据库中寻找miRNA测序或者芯片的数据，自己分析选出有差异的miRNA，这样也是一个省时省力的办法。另外，我们还可以通过“借鉴”的办法来寻找miRNA，举例说，如果我们看文献发现某一个miRNA在某种癌症中发挥重要的作用，那我们可以考量我们正在开展的疾病与已发表的这种疾病之间的关系，从而推测该miRNA是否在我们研究的疾病中也有类似的功能，从而开展后续的研究，这种思路虽然没有太多的创新性，但是也可以找到一个研究的对象。

2.预测靶基因及靶向验证

其实这一步和下面的一步顺序是可以互换的，所以先做哪一个问题都不大。有些研究者得到要研究的miRNA后会想知道到底它是和谁结合的，这时候通过网站预测是最快捷的方法。可以用我们上面推荐的几个数据库来做这个工作，得到miRNA-mRNA的靶向关系对，并对靶向关系对进行验证。miRNA-mRNA的靶向关系对的验证一般会用双荧光素酶实验，原理是miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR，所以把目的基因3’ UTR区域构建到萤火虫荧光素酶后面，然后把构建好的载体与miRNA共转染检测报告基因表达的变化，从而得出miRNA对目的基因的抑制作用。正常情况下构建好的荧光素酶-目的基因3’UTR的载体中荧光素酶报告基因正常表达，所以功能没有发生变化。如果miRNA与载体中的3’UTR发生结合，则荧光素酶报告基因的表达受到影响，导致表达量降低。所以根据报告基因的表达情况我们就可以推断出miRNA与靶基因的3’UTR是否结合。

如果我们想进一步确定具体的结合位点，还可以构建3’UTR突变型载体，前面说过miRNA通过和靶基因结合后导致荧光素酶基因功能下降，如果突变结合位点后miRNA无法结合则其功能又会恢复，由此可以证明miRNA通过该突变位点来结合调控靶基因的。

3.miRNA功能研究

对于基因相关的功能研究无非是过表达或者敲低的手段，在miRNA研究中也不例外。如果这一步是在靶基因预测之后开展，那也可以作为靶基因预测结果的验证，比如做完过表达或者敲低后通过qPCR、WB或者测序等来看靶基因的表达情况，从而验证两者之间的结合关系。相反，如果这一步在靶基因预测之前开展，那可以通过测序筛选出差异的基因，从而起到寻找靶基因的作用，进而再结合荧光素酶实验来验证前面的筛选结果就可以。由此可以看出，虽然技术相同，但是顺序不同发挥的作用也不太一样。

回归正题，miRNA过表达方面常用三种方法，第一是构建miRNA的超表达载体，一般是把miRNA的前体构建到过表达载体中，前体过表达后经过切割产生成熟的miRNA。第二种方法是化学合成的模拟物mimics，通过瞬转进入细胞后可以提高miRNA的含量，起到过表达的作用。第三种是agomir（激动剂），这是在mimics的基础上经过化学修饰的产物，在体内实验中效果更好。通过过表达技术，我们可以看到我们所研究的miRNA的量过多后出现的表型，从而推断出miRNA可能发挥的功能。

miRNA干扰方面一般也有四种方法， 第一是构建目前常用的是miRNA sponge技术，该技术是利用miRNA-mRNA的相互作用设计出带有串联排列的miRNA结合位点的质粒载体转染宿主后，miRNA sponge以mRNA的形式转录至胞质中，诱导具有相似结合域的miRNA结合，解除其对靶基因的抑制。第二是化学合成的Inhibitor，其是与相应miRNA完全互补的单链，瞬转入细胞后直接结合与之互补的miRNA，从而解除对靶基因的抑制。第三是antagmir，这是在Inhibitor的基础上经过化学修饰的产物，在体内实验中效果更好。第四种是miRNA的敲除，前面几种都是在阻止miRNA结合靶基因的角度入手，而该方法是从编码基因的角度入手，将miRNA编码基因给破坏掉。通过这些技术可以降低miRNA对靶基因的抑制作用，从而提高其蛋白的表达量。

基于上述几个实验，我们就可以得到如下结果，这样一个比较完善的思路和体系就出来了。

1. 在对立组（比如癌症和癌旁组织、处理和未处理组）中存在某种差异表达的miRNA；
2. 通过生物信息学手段预测出该miRNA的靶基因并对靶基因关系进行验证；
3. 利用过表达或者干扰等技术来分析miRNA过量或者不足的情况下出现的表型；
4. 进而得出某miRNA可能通过某个靶基因在某种对立的样本中发挥某种作用，进而影响了哪种表型。