ChIP实验没有合适的抗体怎么办？小编教你从头一步步加标签

随着表观组学的流行，ChIP/CUT&Tag已成为科学研究中的热门话题，这两个技术的必须条件是需要合适的抗体，比如ChIP实验最好是有ChIP级别的抗体。但是，当我们感兴趣的蛋白质没有合适抗体时，我们要咋办捏？难道就做不成了嘛？别急，今天小编教大家加标签，把没有合适抗体蛋白质的ChIP实验也一网打尽。

一、ChIP实验为什么需要抗体？

我们都知道，ChIP实验是研究已知蛋白结合的DNA的技术，也就是说我们已经有一个明确的蛋白质，想看看这个蛋白质是和哪些DNA序列结合的，那就可以使用ChIP来实现。在ChIP实验过程中需要先把正常的状态下细胞或者组织样本进行固定，这时相当于把蛋白质和与其结合的DNA“粘”在了一起。我们再使用这个已知蛋白的抗体把蛋白质从细胞裂解产物中抓出来，这时一起结合的DNA也会被抓出来，然后对这部分DNA进行测序，就可以得出这个已知蛋白是和哪些基因结合的。所以，抗体在该实验中发挥巨大的作用，关于抗体的介绍我们在9月12日时发表过一篇“抗体知识小讲堂”的推文，里面详细介绍了抗体是什么以及如何选择，这里就不再赘述。今天我们就重点来介绍没有合适的抗体时我们要怎么办。

二、标签抗体

做过亚细胞定位的老师们估计都对可以发出绿色荧光的GFP蛋白非常有印象，其实这就是一种加标签的办法。我们想研究目的蛋白在细胞中的具体位置，这时候要怎么办呢，我们就把目的蛋白和这个GFP荧光蛋白通过载体构建来实现两者的融合，从而构建出目的蛋白-GFP融合蛋白，这样我们通过GFP的荧光位置就能知道目的蛋白的定位情况。

那相似的原理，如果我们研究的目的蛋白质尤其是转录因子，在没有合适的ChIP级别抗体时，我们也可以通过构建融合蛋白的办法给它加上一个已有合适抗体的小蛋白标签，后续使用这个小蛋白标签的抗体把融合蛋白拉出来，就可以实现ChIP实验啦。

三、加标签的实验过程

加标签的过程就是构建融合基因表达载体的过程，我们加标签时需要选择尽量小，而且不会对目的蛋白的结果产生影响的小蛋白，所以常用的蛋白标签有flag、c-Myc、HA、6xHIS、GFP等，下面我们均以flag为例做介绍。

1、载体的选择及结构查看

如果研究组或者研究者有余力可以自己从头构建载体，那是极好的。如果为了快捷高效，最简单的办法是直接选择已经带有flag标签的载体。这类常见的带有Flag标签的载体有pFLAG-CMV2、pESC-His、pENTR4-FLAG等。其中pESC-His虽然带着His字样，但是其自身带有flag标签。当我们想加flad标签时一般可以选择这几个里面的一种。这个载体的结构或者具体的序列我们可以通过网站查询，比如addgene网站（https://www.addgene.org/），我们输入pENTR4-FLAG检索就可以得到如下的载体结构图，除此之外，关于该载体携带的标签、生长条件等都可以看到（https://www.addgene.org/17423/），这个结构图对我们后续选择合适的酶切位点非常重要。

2、融合载体的构建以及验证

构建融合载体的原理是基于相同的酶切位点可以通过T4 DNA连接酶结合在一起。基于此，首先，我们需要先把目的基因的CDS序列找出来（通过NCBI，寻找目的基因的mRNA，然后找到起始密码子和终止密码子即可，如果还有不明白可以私信小编哈）。第二，设计引物扩增CDS序列。这时需要注意在引物中需要带上可以与载体链接起来的酶切位点。一般载体结构上都存在一个MCS多克隆位点，我们一般选择载体的MCS区域里有的、但是目的CDS序列里没有的两个酶切位点，分别加在设计的上下游引物中。其中需要注意的是两个酶切位点的方向，也就是谁放在上游引物中，谁在下游引物中。除此之外，还需要注意注意flag标签的位置，是加在目的基因的前面还是后面，一般是加在后面，这时目的基因的CDS序列扩增时需要去除终止密码子，因为这样在翻译的时候会继续翻译下面的flag序列。第三，扩增完成后，分别把载体和目的扩增片段进行双酶切并连接，这样就构建好融合载体啦。

构建好的融合载体可以通过酶切或者一代测序的办法进行验证，证明确实是我们理想的插入载体后就可以开展下面的转染、转化实验啦。

3、构建好的载体转入植物、动物细胞或者组织中

转入植物中的方法比如农杆菌介导法、电转法等，在动物细胞或者组织中常用的比如慢病毒、腺病毒以及腺相关病毒等，一般进行细胞转染时主要用慢病毒包装法即可。

4、转染过程中对照的设计

一般需要转一个空质粒载体作为阴性对照即可，另外一个是我们构建好的载体。

5、转入成功与否的验证

上个步骤中我们提到转染细胞时最终是转染一个空载体和一个构建好的融合蛋白的载体。如果我们使用的载体自身就带着标签（比如上面案例中提到的pENTR4-FLAG带着flag标签），转染后可以通过WB来验证是否转染成功。主要原理是使用flag抗体来看这两个样本的条带的位置，融合蛋白比较大，跑的比较慢，所以这个样本的条带在靠近加样孔的位置，而空载体跑的位置会远离加样孔，显示在更前面的位置。

通过第5步的验证后，我们的样本就准备好啦。后面可以正常选择对应标签（本文里都以flag标签为例，那我们就选flag的抗体）的ChIP级别的抗体开展正常的研究啦。