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肿瘤源性凋亡细胞外囊泡介导的细胞间通讯促进肺腺癌的转移和干性

肿瘤的进展及治疗过程伴随细胞凋亡发生，而肿瘤细胞凋亡后的细胞外囊泡（apoEVs）不可避免会被活的肿瘤细胞吞噬从而促进肿瘤异质性。因此了解apoEVs对肿瘤细胞的调控机制有利于提高肿瘤转移和复发的认识。

近日，来自中山大学肿瘤防治中心的研究团队在Bioactive Materials（IF=18）上发表的题为“Tumor-derived apoptotic extracellular vesicle-mediated intercellular communication promotes metastasis and stemness of lung adenocarcinoma”的研究论文。作者团队通过系列体内外实验揭示凋亡肿瘤细胞来源的apoEVs会促进肺腺癌（LUAD）的转移、自我更新和化疗耐药性，其机制和apoEVs介导的干细胞因子SOX2上调以及ALDH1A1关联的NF-κB信号通路密切相关，并进一步证明apoEVs-ALDH1A1可能是LUAD转移和复发的潜在治疗靶点和生物标志物。论文中qPCR分析实验用到的 2X SYBR Green qPCR Master Mix（货号K1070）由APExBIO提供。

研究背景

肺癌是目前死亡率最高的常见恶性肿瘤，肺腺癌（LUAD）是肺癌的主要组织学亚型。肿瘤的复发和转移特性往往导致治疗失败，而癌症干细胞（CSCs）的存在为这种治疗失败提供全新解释。CSCs具有自我更新和分化能力，这使其能够产生多种癌症亚型，了解LUAD如何获得肿瘤干细胞性对于改进现有的治疗方法和减轻肿瘤复发至关重要。值得注意的是SOX2是CSCs中关键的转录因子，在干细胞发育初始阶段的未分化状态中发挥重要作用。然而，目前对癌细胞中SOX2的表达调控的理解仍然有限。另外，在肿瘤病理进展过程中会伴随肿瘤细胞凋亡，已知在肿瘤微环境中存在大量的肿瘤来源apoEVs。这些apoEVs可能介导不同癌细胞群之间的通信，从而改变肿瘤的异质性，促进癌症的进化，因此深入理解CSCs和apoEVs之间的关系对于预防肿瘤的复发转移是十分必要的。

肿瘤来源的apoEVs在体内促进LUAD的转移和干性

首先为了研究凋亡肿瘤细胞来源的apoEVs对活肿瘤细胞的潜在影响，团队将稳定表达荧光素酶的A549肺癌细胞通过尾静脉注射到免疫缺陷小鼠构建肺转移模型，并给予模型鼠PBS和apoEVs研究肿瘤细胞的转移情况。生物发光结果显示注射肿瘤细胞后28天注射正常细胞来源的apoEVs的小鼠与注射PBS的小鼠之间的肺转移的发展没有明显的差异（图1B-C），而注射诱导凋亡的A549分离出来的apoEV（Tumor-apoEVs）则增强了转移性肿瘤的形成（图1B-E），并且观察到Tumor-apoEVs的存在缩短了模型小鼠的生存时间（图1F）。进一步研究apoEVs对肿瘤干细胞特性的影响，发现暴露于Tumor-apoEVs后，肿瘤细胞形成的肿瘤球表现出增强的特征（图1I-J），包括存在大量的肿瘤干细胞样群体。这些结果表明，与来自正常细胞的apoEVs相比，暴露于Tumor-apoEVs的LUAD细胞具有更强的自我更新能力，增加的干细胞性和促进肿瘤转移的倾向。

图1 肿瘤来源的apoEV在体内促进LUAD的转移和干细胞性

肿瘤来源的apoEV促进LUAD细胞中的EMT表型和SOX2转录

团队接下来深入探讨Tumor-apoEVs如何介导LUAD的迁移和干性，通过RNA-seq分析Tumor-apoEVs处理的A549细胞的转录组，表明Tumor-apoEVs能显著影响肿瘤细胞的转录组（图2A）。值得注意的是，Tumor-apoEVs处理的细胞中，上皮间质转化（EMT）相关基因和多能性相关基因发生差异表达（图2B）。EMT的异常重新激活是在肿瘤细胞中获得恶性表型的先决条件，包括增加迁移和侵袭能力，与癌干细胞也有复杂的关系。作者选择了涉及EMT和干性的基因，通过实时定量PCR分别验证其表达模式（图2C-D）。与预期一样，同PBS或正常apoEVs相比，Tumor-apoEVs处理后EMT相关基因和SOX2显著上调，表明肿瘤来源的apoEV在促进LUAD细胞的EMT表型和SOX2转录发挥了关键作用。

图2 肿瘤-apoev激活LUAD细胞中的EMT表型和SOX2信号通路

SOX2与经典治疗后残留的LUAD肿瘤的复发和干性相关

为了全面评估SOX2表达在治疗后肿瘤样本中的潜在预后价值，团队从79例诊断为可切除的III期LUAD的患者中获得了残留的手术肿瘤样本。这些患者在接受了新辅助化疗后又接受了手术切除（图3E）。结果显示SOX2在切除的残留肿瘤样本中的表达与较差的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）显著相关（图3G-H）。此外，团队还从接受新辅助化疗或靶向治疗的患者中收集了9份新鲜肿瘤样本评估SOX2表达与肿瘤球形成能力之间的关系，在SOX2低表达的样本（3/3）中观察到肿瘤细胞不能繁殖，而在SOX2高表达的样本（4/6）中观察到肿瘤细胞可以至少繁殖3代（图3J）。这些结果表明，在常规治疗后的LUAD患者中，SOX2的表达与患者预后不良呈正相关，且SOX2在LUAD干细胞中表达上调。

图3 SOX2高表达与常规治疗后LUAD患者的不良预后和CSCs相关

ALDH1A1在肿瘤来源的apoEV中富集，并在LUAD中负责ALDH酶活性

为了确定介导肿瘤来源的apoEV功能的特定蛋白，作者团队对Tumor-apoEVs和正常apoEVs中包含的蛋白进行蛋白组学分析，发现在Tumor-apoEVs中上调的蛋白中存在高水平的乙醛脱氢酶（ALDH）。蛋白水平排名显示ALDH1A1是Tumor-apoEVs中丰度最高的蛋白（图4G），通过免疫印迹分析也证实Tumor-apoEVs中ALDH1A1的表达上调（图4I）。已有报道ALDH1A1的过表达与促进肿瘤起始和肿瘤进展有关，提示apoEV-ALDH1A1可能是一种导致肿瘤转移和干性的功能蛋白。

图4 蛋白质组学分析显示ALDH1A1是apoEV中的重要功能蛋白

apoEV-ALDH1A1通过NF-κB信号通路上调LUAD细胞中SOX2的转录

NF-κB通路的激活可以调节SOX2的转录和EMT的起始，从而介导癌细胞的迁移、干细胞性和化疗耐药性。为了验证Tumor-apoEVs诱导的ALDH活性的增加是否会激活NF-κB/SOX2信号通路，作者对用apoEV处理的LUAD细胞中ALDH酶活进行测量，结果表明Tumor-apoEVs处理的LUAD细胞中ALDH酶活性显著升高，而PBS和正常apoEVs处理的LUAD细胞ALDH酶活没有升高（图5A），进一步研究发现ALDH+细胞群比ALDH-细胞群具有更强的迁移能力和自我更新能力（图5C-J）。免疫印迹结果表明Tumor-apoEVs处理的ALDH +群体p65和IκBα磷酸化水平增加（图5K-L)。对模型鼠的肿瘤组织切片进行ALDH1A1和SOX2免疫荧光分析也显示Tumor-apoEVs处理后的肿瘤组织中ALDH1A1和SOX2强烈共表达（图5M），证实ALDH1A1和SOX2之间的密切关联。

图5 apoEV-ALDH1A1参与激活NF-κB /SOX2信号通路

靶向ALDH1A1可抑制肿瘤的转移和干细胞性

最后，团队使用ALDH靶向抑制剂双硫仑（DSF）探究能否控制LUAD的复发和转移及其干性。实验结果证实通过降低apoEVs中ALDH1A1的蛋白水平或用DSF处理细胞，可以降低apoEV-ALDH1A1诱导的p65和IκBα的磷酸化水平（图6C）。在功能上，细胞的迁移、侵袭和自我更新能力也下降，这与NF-κB信号传导结果一致（图6D-E）。此外，DSF的治疗也能降低经Tumor-apoEVs处理的LUAD细胞的肿瘤球形成能力（图6G-H），以及肿瘤转移能力（图6I）。综上所述，靶向ALDH1A1为开发新的、可靠的LUAD治疗策略提供了一个很有前途的方向。

图6 抑制apoEVs-ALDH1A1能降低LUAD迁移、侵袭、耐药和干性的活性

结论

本研究证明来自凋亡肿瘤细胞的apoEVs促进了LUAD的转移和干细胞性，与癌症复发和治疗耐药性密切相关，其潜在机制依赖于ALDH1A1/NF-κB/SOX2信号通路和干细胞样群体的激活，为包括细胞毒性化合物和ALDH抑制剂在内的联合治疗提供了新的理论基础，并为预防肿瘤复发提供了新的可能性。