萤光素酶技术应用第三弹：蛋白互作研究

# 萤光素酶技术应用 | 第三弹

蛋白互作研究

蛋白质是生命活动的主要承担者，不过绝大部分蛋白质不会单独发挥作用，而是要通过蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）来完成任务。异常的蛋白互作可能会导致功能障碍乃至一系列疾病的发生。因此深入研究蛋白质相互作用不仅有助于揭示生命现象的本质，而且对于疾病机理的解析和新药的开发都具有极其重要的意义。

目前，常见的蛋白互作检测技术主要包括酵母双杂交（Y2H）、免疫共沉淀（Co-IP）、双分子荧光互补（BiFC）、荧光共振能量转移（FRET）、生物层干涉（BLI）和Pull-down等。

萤光素酶互补（Luciferase Complementation Assay, LCA）是在BiFC基础上发展出来的一种技术，简而言之就是将萤光素酶切成N端和C端两个功能片段，并分别与待检测的目标蛋白融合。如果两个目标蛋白有相互作用，则N端片段和C端片段在空间上靠近并互补，从而发挥萤光素酶活性，催化底物产生光（图一）。因为灵敏度高、操作简单、可用于定量化研究，LCA近些年被广泛应用于动植物的蛋白互作研究。

本期我们就来为大家介绍一下LCA分别在植物和哺乳动物细胞中检测蛋白互作的流程。

图1: 萤光素酶互补（LCA）检测蛋白互作原理

(图源自网络)

01 植物蛋白互作

虽然一开始LCA是用于哺乳动物细胞内的蛋白互作检测，但是后来LCA却越来越多的应用在植物蛋白互作中。这是因为对于植物体系来说，LCA操作简单，灵敏度高，此外通过烟草瞬时表达系统，可以快速检测到蛋白质相互作用。而且LCA可以借助活体成像仪直接在活体植物中进行蛋白互作检测，更能反映自然生理状态下的相互作用。这里我们就以烟草（Nicotiana benthamiana）为例介绍一下植物中LCA实验的一般流程。

1 目的蛋白载体构建

之前我们在萤光素酶技术应用第一弹：小动物活体成像全流程详解中介绍过萤火虫萤光素酶（FLuc）是最常用的一种萤光素酶，FLuc也是LCA中最常使用的酶。FLuc可以分成N段片段NLuc和C段片段CLuc。实验时可以直接购买适合植物研究的NLuc和CLuc载体，如pCAMBIA1300-NLuc和pCAMBIA1300-CLuc、pGWB-NLuc和pGWB-CLuc；也可以从其他NLuc和CLuc载体上克隆到植物研究的载体上。

随后利用载体上的酶切位点将待检测的可能存在相互作用的蛋白基因片段A和B分别克隆到NLuc和CLuc载体上，如pCAMBIA1300-A-NLuc和pCAMBIA1300-CLuc-B。

载体验证构建正确后分别转化农杆菌感受态（GV3101），按要求恢复培养并在含对应抗生素（如、庆大霉素（A2514））的LB平板上培养过夜。

Tips：

• 自行将目的蛋白基因片段克隆到NLuc和CLuc载体上时，需要注意片段插入位点，一般NLuc需要位于目的蛋白的C端，而CLuc在N端或者C端都可以。

2  烟草转染

分别挑取LB平板上的单菌落，接种到LB液体培养基中（含对应抗生素），扩大培养。培养到合适密度时（如OD600达到1），离心收集菌体，用MS液体培养基清洗2次。将这两种扩大培养得到的菌液按1:1体积比混合。随后将混合好的菌液用无针头的注射器注射到烟草叶片背面。为了保证结果的可靠性，对照组和实验组必须在同一叶片的不同部位进行，以保证相同的背景。随后正常生长24-48 h后即可进行观察。

3 叶片成像

农杆菌注射24-48 h后，用含有FLuc底物D-luciferin（C3654）的溶液喷洒在叶片背面，并避光静置一段时间（如10 min）。随后取下叶片，将其背面向上置于容器中并在植物活体成像仪中检测发光效果。如果对照组不发光，而实验组发光，则证明两个研究蛋白之间存在相互作用。成像结果类似下图举例。

图2:通过LCA检测蛋白OsBIK1-OsXLG2互作

(引自植物学报,2020,55(01):69-75.)

02 哺乳动物细胞内蛋白互作

蛋白质通过蛋白-蛋白相互作用发挥作用，并且与许多疾病密切相关。靶向蛋白-蛋白相互作用开发抑制剂是目前新药开发的重要方向之一。与其他蛋白-蛋白相互作用检测方法相比，LCA可以轻松用于大规模的蛋白互作抑制剂的筛选，即满足药物开发的高通量筛选需求。哺乳动物细胞内的LCA检测流程与上述植物系统的大概类似，具体流程如下：

1 目的蛋白载体构建

类似的，在动物细胞实验上最常用的萤光素酶也是FLuc。可以直接购买用于动物细胞的NLuc和CLuc载体，如pcDNA3.1-NLuc和pcDNA3.1-CLuc；也可以从其他NLuc和CLuc载体上克隆到合适的载体上。

随后利用载体上的酶切位点将待检测的可能存在相互作用的蛋白基因片段A和B分别克隆到NLuc和CLuc载体上。如pcDNA3.1-A-NLuc+pcDNA3.1-CLuc-B。

将上述构建正确的质粒分别转化感受态（如DH5α（BC2000）），按要求恢复培养并在含对应抗生素（如氨苄青霉素钠（K2801））的LB平板上培养过夜。分别挑取单克隆并送测序验证构建是否成功。构建成功后分别进行保菌并进行质粒抽提以得到质粒备用。

2 细胞转染

细胞铺板并正常培养，随后使用转染试剂，如PEI40000（K1029）、Lipo3K（K2705），将两种质粒共转染到细胞内，继续培养一段时间。

3 检测

转染24-48 h后，往细胞中加入萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂（K2246），孵育10 min后通过多功能酶标仪检测发光信号。也可以直接添加底物D-luciferin（C3654）溶液后进行检测，但是信号强度可能不如含有裂解液的报告基因检测试剂。

4 大规模筛选

LCA在哺乳动物细胞上通常用于大规模的蛋白互作抑制剂筛选，通过上述流程确立好LCA筛选平台，随后通过不同药物处理，并检测发光信号相对于不做处理时的变化，可以筛选出相应的互作抑制剂或者激动剂。

【文献举例】

FGF14是成纤维细胞生长因子（FGF）家族的一员，主要在发育中及成熟的神经系统中表达。FGF14与多种离子通道的功能密切相关，尤其是可以通过与钠离子通道Nav1.6的相互作用调节神经元兴奋性。已知FGF14-Nac1.6的异常激活与许多疾病密切相关，因此筛选FGF14-Nac1.6相互作用抑制剂对于临床研究有重要意义。

美国得克萨斯大学的研究者通过LCA建立了一个FGF14-Nac1.6相互作用抑制剂的筛选平台，并以此对267个FDA批准药物进行了初筛，随后对初筛得到的阳性化合物继续筛选后最终发现了一个高活性的抑制剂。

图3:通过LCA筛选FGF14-Nac1.6抑制剂

(引自Sci Rep. 2019 Nov 15;9(1):16890.)

相关链接：

萤光素酶技术应用第一弹：小动物活体成像全流程详解

萤光素酶技术应用第二弹：植物活体成像应用