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靶向mRNA纳米颗粒通过调节小胶质细胞极化改善缺血性卒中后血脑屏障破坏

缺血性脑卒中其死亡率和致残率极高，是全球主要的健康问题之一。然而，目前缺乏有效的临床干预措施来治疗卒中后神经炎症和血−脑屏障（BBB）破坏，这对脑损伤的发展和神经缺陷至关重要。

近日，来自上海交通大学药学院的研究团队在ACS nano上发表题为“Targeted mRNA Nanoparticles Ameliorate Blood−Brain Barrier Disruption Postischemic Stroke by Modulating Microglia Polarization”的研究论文。

团队开发了一种靶向M2小胶质细胞的脂质纳米颗粒（MLNP），将编码表型转换的白细胞介素-10（mIL-10）mRNA递送至缺血大脑后，可以促进脑卒中小鼠模型的小胶质细胞向保护型M2转化，增强mIL-10在脑缺血区域的聚集，由此消退神经炎症并恢复受损的血脑屏障，并防止卒中后的神经元凋亡，是对缺血性卒中和相关脑疾病的有潜力的治疗策略。

图1 LNP介导的IL-10进入脑缺血区M2小胶质细胞用于卒中后神经修复的示意图

该研究使用的以下产品均由APExBIO提供。

研究背景

缺血性卒中是导致全球成人死亡和残疾的第二大原因，尽管目前重组组织型纤溶酶原激活剂（rtPA）和血管内血栓切除术（EVT）的临床治疗方案使一些患者受益，但血−脑屏障（BBB）破坏和卒中后继发性神经元损伤的临床问题仍未得到充分的解决，开发能够有效减轻神经炎症和保持血脑屏障完整性的治疗策略，以保护卒中后的神经功能仍是研究重点。

有证据表明神经免疫反应是缺血性卒中的重要组成部分，在病理进展中，中枢神经系统(CNS)的先天免疫细胞，即小胶质细胞，会经历从早期的保护性M2到M1表型的快速转换，并伴随各类炎症因子的上调，导致随后炎症、血脑屏障破裂和神经元死亡，这一过程表明驱动小胶质细胞从M1向M2表型转换的药物将是非常具有吸引力的，而IL-10这类强大的抗炎细胞因子正可促进小胶质细胞的M2极化，减缓神经炎症及血脑屏障破坏，并恢复缺血性卒中后的神经功能。然而IL-10由于其血浆半衰期短（约3 min），以及高剂量全身给药带来的免疫抑制和感染风险，其临床应用一直受到限制。同时，mRNA目前由于其灵活性、可扩展性和理论可编码任何感兴趣的蛋白质的能力，正迅速发展为防治各种疾病的核酸药物，但靶向递送载体的缺乏仍旧限制mRNA药物的进一步应用。

因此，亟需开发新的递送策略，将IL-10 mRNA选择性的递送至缺血脑中局部，驱动小胶质细胞向M2表型极化，解决脑缺血性卒中后加剧脑损伤和血脑屏障破坏的神经炎症。

研究工作

1. mRNA-LNPs的合成和表征

为了实现对M2小胶质细胞的靶向设计，研究团队选择对M2小胶质细胞具有高亲和力的甘露糖合成甘露糖偶联的DMG-PEG（DMG-PEG-甘露糖），与氨基电离脂质AA3-Dlin、DOPE和胆固醇等组分通过微流控的方式组装成MLNPs，并通过动态光散射、透射电镜以及浊度测量等对其理化性质进行分析。数据显示团队所开发的MLNPs具有稳定的纳米结构，能够保护装载其中的mRNA不被降解。

图2. mIL-10/LNPs的制备和表征

2. MLNPs在体内外均靶向M2极化的小胶质细胞

接下来团队对所制备的MLNPs进行体内外靶向实验验证。首先使用Cy5标记的胆固醇构建mIL-10/LNPs，并通过采用IL-4刺激的M2极化小胶质细胞检测合成的Cy5 LNPs的细胞内化情况。流式细胞结果显示甘露糖的掺入能导致M2小胶质细胞对mIL-10@Cy5 MLNP的摄取增加，而在不过表达CD206的星形胶质细胞则没有观察到mIL-10@Cy5MLNPs的摄取增强（图3A、B）。共聚焦成像也显示与非靶向mIL-10@Cy5LNPs相比，mIL-10@Cy5 MLNPs和M2小胶质细胞表面表达的CD206之间的共定位程度更高，这些结果表明，M2小胶质细胞对MLNP的摄取增强主要依赖于甘露糖受体介导的内吞作用。

在随后的tMCAO小鼠模型体内实验中，静脉注射的Cy5 MLNPs通过体内成像显示，甘露糖的掺入显著增加mIL-10@Cy5 MLNPs的大脑积累水平（图3F）。脑切片的免疫荧光也同样显示出mIL-10@Cy5MLNPs与CD206+小胶质细胞大量的共定位（图3H），CD206+脑小胶质细胞的流式结果同样表明对mIL-10@Cy5MLNPs的摄取比对非靶向mIL-10@Cy5LNPs的摄取更高（图2I），ELISA检测接受mIL-10@ MLNP治疗的小鼠脑缺血半球中IL-10的表达也更显著增加（图3K），综上结果证明MLNPs可以通过配体−受体的相互作用特异性靶向M2小胶质细胞，从而促进负载mRNA的MLNPs归巢到脑缺血区域。

图3. mIL-10/LNPs的体外细胞摄取及tMCAO小鼠静脉给药后脑缺血区的靶向能力

3. 体外评估MLNP介导的mRNA转染及抗炎作

作者对MLNP介导的mRNA的转染效率及抗炎作用也做了相应研究，使用EGFP评估MLNPs在小胶质细胞中的转染效率。流式及荧光染色结果表明EGFP@MLNPs相比商业转染试剂MFI 3000（L3K）具备更高的转染效率（图4A)，更好的核内体逃逸能力，以及良好的生物相容性（图4B、C）。对分离的原代小胶质细胞和BV2细胞中进行IL-10 mRNA转染可以看出mIL- 10@MLNPs处理能显著提高IL-10的表达水平，并能抑制脂多糖（LPS）刺激的小胶质细胞中TNF-α的产生（图4E），以及增加保护性和营养因子如Arg-1和TGF- β的产生（图4G、H），结果表明mIL-10@MLNPs促进小胶质细胞向抗炎M2表型转换。

图4 评估mIL-10@MLNPs的体外转染效果和抗炎特性

4. mIL-10@MLNP治疗可改善tMCAO小鼠模型中的血脑屏障损伤和神经元死

接下来，作者探讨在tMCAO小鼠模型中，MLNPs选择性地将mIL-10递送到大脑M2小胶质细胞的治疗结果。对脑切片进行内源性血浆IgG染色，IgG对应的绿色荧光信号的减少证明mIL-10@MLNP处理能显著改善血脑屏障的破坏（图5B）。此外，微管相关蛋白-2（MAP-2）染色结果显示与对照组相比，低剂量或高剂量的mIL-10@MLNPs治疗组均显示平均梗死体积减少（图5B、D）。紧密连接蛋白ZO-1（内皮屏障标志物）的阳性免疫荧光染色图像显示结果与IgG染色结果一致，静脉注射mIL-10@ MLNPs后导致ZO-1表达升高，并恢复受损血脑屏障的完整性（图5E）。TUNEL染色结果也表明mIL- 10@MLNP处理可显著抑制tMCAO术后的神经元凋亡（图5G）且呈剂量依赖性。

图5 mIL-10@MLNPs对tMCAO小鼠血脑屏障完整性和神经元存活的治疗性验证

5. mIL-10@MLNP治疗可促进小胶质细胞的M2极化，并解决缺血性卒中后的神经炎症

为了进一步了解mIL-10@MLNPs对缺血性卒中的治疗作用机制，作者检测了tMCAO小鼠中的IL-10的表达水平和小胶质细胞表型的变化。结果显示，与接受PBS或MLNP治疗的脑半球分离的小胶质细胞相比，IL-10的表达显著增加（图6A、B），CD206阳性小胶质细胞的计数同样显著增加（图6C、D），也减少了大脑CD86+小胶质细胞的数量（图6E、F）。数据表明由MLNPs介导的脑缺血区成功产生生物活性IL-10，可以有效地将小胶质细胞向M2表型转移，将病理微环境重构为抗炎状态，从而增强神经炎症的消退。Arg- 1是M2极化小胶质细胞的典型标志，有利于组织修复和神经保护。相反，TNF-α在与多种神经系统疾病相关的神经炎症反应中起着关键作用，通过定量脑切片中Arg- 1和TNF-α等关键炎症相关生物标志物的表达同样和预期结果一致，mIL-10@MLNPs与PBS或MLNP治疗相比能显著提高Arg-1的脑表达，以及TNF-α的表达急剧降低到与假手术组相当的水平（图G、I），表明mIL-10@MLNPs具有强大的抗炎作用。

图6 mIL-10@MLNP治疗对tMCAO小鼠的小胶质细胞表型转移和神经炎症消退的影响

6. mIL-10@MLNP治疗可以防止dMCAO小鼠模型的神经元功能障碍

作者通过建立另外的dMCAO小鼠模型，用以评估mIL-10@MLNPs对永久性脑缺血所致组织损伤和功能缺陷的影响，采集治疗后的脑组织进行组织学分析。与PBS或MLNP治疗相比，mIL-10@ MLNPs治疗显著减少了梗死体积，并减轻了卒中后IgG的外渗（图7B）。永久性脑缺血卒中常伴随轴突损伤和脱髓鞘，导致感觉运动和认知神经功能障碍，通过外囊和纹状体切片的免疫荧光染色显示，接受PBS或M-HNP治疗的小鼠脑切片对SMI32（轴突丢失的标志物）具有高亲和力，并且缺乏MBP（髓鞘在外包膜和纹状体部分的完整性的标志)免疫信号。有趣的是，使用mIL-10@MLNPs治疗则发现SMI32荧光信号消失和MBP免疫反应性恢复，表明恢复了dMCAO小鼠大脑外囊和纹状体的完整性（图7E）。最后使用Garcia评分、巴恩斯迷宫等多种行为测试来评估小鼠永久性脑缺血后的神经功能缺陷情况。与上述免疫荧光结果一致，接受mIL-10@MLNP治疗的小鼠在卒中后的总神经系统评估得分显著高于对照组（图7H），这些结果共同表明，靶向M2小胶质细胞的mIL-10@MLNPs通过减少脑卒中后的梗死体积，改善感觉运动和认知功能，发挥强大的神经保护作用。

图7 mIL-10@MLNPs在缺血性中风的dMCAO小鼠模型中的治疗结果

7. 在体内安全评估

研究最后，作者通过组织学、血液生化指标等评估健康小鼠使用mIL-10@ MLNPs治疗的安全性。HE染色显示接受mIL-10@MLNP治疗的小鼠的主要器官（心、肝、脾、肺、肾和脑）没有明显的损伤迹象（图8A）。此外，包括红细胞计数（RBC）、白细胞计数（WBC）、血红蛋白（HGB）、等各项生化指标均没有显著差异（图8B）。数据强烈表明团队合成的MLNP平台是安全无毒的。

图8 C57BL/6小鼠的安全性评价

研究结论

本研究主要开发了一种具有M2小胶质细胞靶向能力的mRNA的LNP递送方法，用于将编码表型转换的IL-10 mRNA递送到脑缺血区域的小胶质细胞内，进行卒中后的组织修复和功能恢复。IL-10的靶向递送可引起抗炎IL- 10的有效分泌，并增强小胶质细胞向M2表型的极化，这反过来会增加LNP在缺血区域的积聚，从而形成正反馈放大抗炎作用，减轻卒中后血脑屏障的破坏，并恢复神经功能障碍，为治疗缺血性卒中和相关神经系统疾病提供有希望的途径。