WGBS可识别胰腺癌阶段和细胞亚型特异性的DNA甲基化特征

WGBS技术简介

WGBS即全基因组甲基化测序（Whole Genome Bisulfite Sequencing）是DNA甲基化研究的金标准，通过重亚硫酸盐Bisulfite处理，描绘全基因组单碱基分辨率的DNA甲基化图谱。主要优势为：1. 精准鉴定CpG富集位点 ，达到单碱基分辨率；2. 覆盖全基因组，获得的甲基化信息更完整，是DNA甲基化研究的金标准。

主要应用：

1. 绘制全基因组单碱基分辨率甲基化图谱

2. 研究胚胎发育、衰老等生理活动发展的表观遗传机制

3. 研究疾病相关甲基化分子标志物

DNA甲基化研究一直以来都是肿瘤疾病，健康衰老的研究热点。2024年4月，加州大学与韩国首尔国立大学合作发表一篇名为“Whole-genome bisulfite sequencing identifies stage- and subtype-specific DNA methylation signatures in pancreatic cancer”的研究文章引起了广泛关注。这项研究对小鼠和人胰腺导管腺癌（PDAC）类器官进行了全基因组亚硫酸盐测序（WGBS），首次检测到 PDAC 特定阶段和亚型的差异甲基化区域（DMR）可作为鉴别PDAC不同阶段和特异性分子亚型的功能性标志物。

研究简介

胰腺导管腺癌（PDAC）是胰腺癌中最常见的类型，占所有胰腺癌病例的90%以上。已有全外显子测序结果表明PDAC的遗传基础包括常见的体细胞点突变(SNV)和拷贝数变异(CNV)。然而，晚期PDAC疾病进展的驱动因素尚未完全明确。表观遗传如DNA甲基化（已被证明在各类癌症中广泛改变）可能是疾病恶化进展的主要贡献者。

基于本文研究，识别出了数千个差异甲基化区域（DMRs），这些区域可以区分PDAC的阶段和分子亚型。阶段特异性DMRs与神经系统发育和细胞-细胞粘附相关的基因有关，并丰富在启动子和二价增强子中。亚型特异性DMRs在鳞状亚型（squamous subtype)中显示出GATA6前肠内胚层转录网络的高甲基化，而在祖细胞亚型(progenitor subtype)中显示出上皮-间质转化(EMT)转录网络的高甲基化。这些结果表明，异常的DNA甲基化既有助于PDAC的进展，也有助于亚型的分化，从而产生具有诊断和预后潜力的显著和重复的DNA甲基化模式。

技术方法

样本来源

PDAC患者或正常人来源类器官：31例早期疾病（可切除或边界性）或晚期疾病（局部晚期或转移性）患者的肿瘤组织（hT），4例手术切除的正常胰腺组织（hN）。

小鼠PDAC模型类器官：2例C57BL/6J小鼠的正常胰腺导管类器官（mN)，2例KC（Kras+/LSL-G12D; Pdx1-Cre）小鼠PanIN病变类器官（mP），4例KPC（Kras+/LSL-G12D; Trp53+/LSL-R172H; Pdx1-Cre）小鼠原发性肿瘤类器官(mT)及4例其配对转移肝或腹膜组织类器官(mM)。

实验方法

DNA分离和全基因组甲基化文库制备

提取上述样本DNA，通过亚硫酸氢盐转化DNA制备甲基化文库后进行测序。

WGBS数据处理

对WGBS数据进行处理（利用FastQ Screen、Bowtie 2、SAMtools等软件），包括质量控制、参考基因组比对和甲基化水平计算。

差异甲基化分析

通过差异甲基化区域（DMR）分析（利用DMRichR R包执行），识别在不同阶段和亚型之间的显著甲基化差异。

DMR基因功能富集分析

通过对 TSS 上游 3Kb 和 3' UTR 下游 3Kb 之间的 DMR基因进行基因本体（GO）和KEGG通路富集分析（利用richR 预测），以揭示与甲基化变化相关的生物过程和信号通路。

机器学习

使用机器学习方法，通过随机森林算法和 sigFeature中的支持向量机递归特征消除方法（SVM-RFE）构建二元分类模型识别能够区分不同PDAC亚型的最小DMR集。

公共数据集分析

结合公共数据集（如TCGA）做生存曲线进行进一步分析验证。

研究结果

1、全基因组水平DNA甲基化在PDAC各阶段的变化

研究发现，在PDAC的每个阶段DNA甲基化水平发生了显著变化。通过对样本所检测的CpG进行主成分分析（PCA）和单个CpG甲基化值的密度图，展示了小鼠和人类类器官中甲基化模式的差异。数据显示，小鼠类器官中的全局甲基化水平在肿瘤样本中较低， mN 和 mP 类器官的全局甲基化水平（分别为 66% 和 67%）高于 mT 和 mM（分别为 61% 和 63%）；人类hT 类器官具有最高的整体甲基化（73%），其次是边缘性和局部晚期（分别为 67% 和 69%），最后是转移性类器官（62%）；结果表明平均的全基因组甲基化水平会随着疾病的侵袭性而降低。

图一：不同PDAC阶段，全基因组甲基化水平的变化

2、小鼠类器官中的DMR分析

在小鼠类器官 mN/mP 与 mM 的比较中，该研究鉴定出了 20,392 个显著 DMR (q < 0.01)；在mT 与 mM 比较中，同样识别出4116个显著的DMR(q < 0.01)；且在 mT和 mM 对比中，发现82% 的DMR 与 mN/mP和mM组对比的DMR重叠；这3395个重叠的差异甲基化位点展现了mM组甲基化信号，该特征清晰地将远处转移灶（mM）与正常胰腺组织(mN)、胰腺上皮内肿瘤(mP)和原发肿瘤(mT)分开。然后作者对这两个 DMR 集的基因分别进行了GO和KEGG分析，发现基因显著富集在与神经发育和癌症信号相关的通路中。

图二：小鼠类器官的DMR分析鉴定出转移性类器官中独特的 DNA 甲基化特征

3、人类类器官中的DMR分析

在人类早期PDAC类器官和晚期PDAC类器官之间识别了5274个与晚期疾病显著相关的DMR(q < 0.05)，这些DMR相关的基因显著富集在与细胞粘附相关的生物过程、与突触信号传导相关的细胞成分以及与神经递质活性相关的分子功能中，且该研究发现这些DMR在晚期PDAC类器官中几乎全部低甲基化。

图三：人类类器官的DMR分析可识别与晚期疾病相关的DNA甲基化特征

4、亚型特异性DMR分析

目前PDAC 标本已确定两种主要的分子亚型，即祖细胞(progenitor)和鳞状细胞(squamous)，它们具有不同的分子特征和临床预后。作者通过对不同亚型hT类器官进行DMR分析，识别了能够区分PDAC两种亚型的3,751 个显著DMR（p <0.05）。随后使用机器学习方法（构建二元分类模型）进一步鉴定了最小的DMR集，结果表明PDAC 的两种主要分子亚型具有不同的 DNA 甲基化特征，鳞状 PDO 中的祖细胞转录网络存在高甲基化，TET 酶参与了 GATA6 靶基因的表观遗传重塑，从而促进了 PDAC 中祖细胞亚型的形成。

图四：鳞状 PDO 的祖细胞转录网络存在高甲基化现象

研究结论

该研究首次通过WGBS技术，全面分析了PDAC类器官中的DNA甲基化图谱，揭示了PDAC中特定阶段和亚型的DMR。这些DMR不仅验证了先前观察到的DNA甲基化对基因表达和信号通路的影响，还揭示了DNA甲基化在PDAC进展和亚型分化中起重要作用，为我们理解胰腺癌的发展和治疗提供了新的视角，具有重要的诊断和预后指导潜力。

文献原文链接：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10963232/

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