WB实验-完整解决方案

介绍

蛋白质印迹（Western Blot，WB）是一种用于检测特定蛋白质的免疫学检测技术，最早由W. Neal Burnette在1979年开发，灵感来源于Southern Blot（用于DNA检测）和Northern Blot（用于RNA检测），Western Blot技术的名称也因此得来。它结合了凝胶电泳和抗体检测的原理，能够在复杂的蛋白质混合物中识别和定量特定的蛋白质。目前该技术已经广泛应用于检测和定量特定蛋白质、研究蛋白质表达和修饰、研究蛋白质-蛋白质相互作用等各个方面，同时在疾病相关蛋白质检测诊断、对特定蛋白质的药效评估等方面也有重要作用。

WB实验流程一般包括样品制备、凝胶电泳、转膜印迹、免疫学检测等步骤。

流程图

WB实验常见流程图

一、样品制备  

以SDS-PAGE实验为例，前期样本制备包括从细胞或组织中获取蛋白质样本、蛋白样本的保护、蛋白浓度测定和蛋白变性处理等四步。

1、蛋白样本获取

• 动物细胞：用细胞刮等直接将细胞刮下并离心收集后裂解或直接在培养皿中裂解处理。注：不建议使用胰酶消化处理。
• 动物组织：可直接采用RIPA裂解液或其他合适的裂解液处理，大块蛋白可先用剪刀等剪碎再裂解处理。
• 植物组织：可采用机械破碎法（研磨法或超声波破碎法）和化学裂解法（如碱裂解法或酶解法）等处理裂解细胞。
• 细菌/真菌细胞：可采用酶解法、化学裂解、机械破碎等方法裂解。

2、蛋白样本的保护-抑制剂Cocktail

细胞裂解后，内源性或者外源性的蛋白酶和磷酸酶等酶会被释放出来，这些酶会降解或修饰目标蛋白，影响实验结果。抑制剂Cocktail是一种混合了多种抑制剂的溶液，通常用于生物化学和分子生物学实验中，以防止蛋白质、酶或其他生物分子的降解或非特异性活性。

3、蛋白浓度测定

凝胶电泳（SDS-PAGE）要求确保每个样品中蛋白质量一致，后续的结果才更加可信，蛋白定量常用的方法包括Bradford考马斯亮蓝法（染料结合）和BCA法（铜离子结合）。BCA法比Bradford法灵敏度更高，并且抗干扰能力更强，兼容去垢剂，但是不兼容还原剂；Bradford法能够兼容还原剂，根据裂解液的成分选择合适的定量试剂盒。

4、蛋白变性

在SDS-PAGE实验中需要解除蛋白的多维结构，保持链式结构进行后续进行电泳。通常使用还原剂如β-巯基乙醇（BME）和二硫苏糖醇（DTT）破坏蛋白的二硫键，使蛋白以单体形式存在，同时在含有SDS溶液内，通过加热煮沸变性处理破坏蛋白三维结构，便于抗体接近抗原表位。

在变性凝胶电泳下，按照上样缓冲液中是否含有还原剂分为还原型和非还原型蛋白上样缓冲液（Loading buffer）。

二、凝胶电泳

1、凝胶制备

• 浓缩胶：常见浓度为3-5%之间
• 分离胶：常按照蛋白分子大小进行丙烯酰胺浓度优化

注意：当蛋白分子量较大时，如大于300 kDa，配置胶时可添加琼脂糖增加硬度。

2、蛋白电泳—预制胶

APExBIO可提供Tris-Gly/Bis-Tris/Universal三种类型预制胶，Universal预制胶可适配多种电泳缓冲液（如Tris-Gly/Hepes/MOPS/ MES）。预制胶包含梯度浓度和固定浓度两种类型，梯度浓度包括（4-15%，4-20%，8-16%与8-20%），固定浓度胶包括（10%，12%与15%），点样孔数分别为10孔和15孔。预制胶内不含SDS成分，后续可用于变性和非变性电泳。当使用超快电泳缓冲液（Cat.#: H2003），在220V电压下，20 min即可完成电泳。

3、上样和电泳

蛋白质marker（也称为蛋白质标准品或分子量标准品）在Western Blot中起着重要的作用，主要用于确定目标蛋白质的分子量。APExBIO拥有一款通用型蛋白预染marker，分子量大小从10 kDa到250 kDa。三种不同颜色结合到蛋白质上，有9条蓝色条带，一条红色条带在70 kDa处，一条绿色条带在25 kDa处。

三、转膜印迹

电泳完成后，可选择将凝胶中的蛋白转移到转印膜上，即蛋白转膜操作，常见的转印膜有NC膜和PVDF膜。其中PVDF膜基于其蛋白结合能力强和机械强度高等特点，在WB实验中广泛应用。

转膜完成后对膜进行封闭，可防止后续抗体和膜发生非特异性结合，常用的封闭剂有BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶等，缓冲液通常有TBST或者PBST。

四、免疫学检测  

针对转膜后的目标蛋白进行检测，可先用一抗孵育，再用二抗孵育，因二抗通常带有酶或荧光标记可进行后续检测。

1、抗体孵育

2、蛋白检测

电泳后的蛋白检测可采用负染（如锌染）、银染或考马斯蓝染色检测，如果凝胶中的蛋白需要进行转膜则需可逆的锌染法，否则可以采用不可逆考马斯亮蓝法染色。

若蛋白电泳后进行转膜操作，蛋白条带常通过二抗上的HRP酶配合ECL发光底物进行检测。

3、抗体再生

蛋白抗体剥离缓冲液（Striping buffer）通常用于从膜上去除抗体，以便可以重新探测同一膜上的其他蛋白。

4、其他常见缓冲液

五、磷酸化蛋白检测（特殊）

蛋白磷酸化是一种重要的蛋白翻译后修饰形式，可改变蛋白结构，进而调控靶蛋白的功能、位置和特异性结合，因此对磷酸化蛋白的检测对评估多种生物学和病理过程非常重要。

Phosbind是一种新型的磷酸盐结合标签和功能分子，在中性pH（生理pH）条件下可以特异性结合磷酸离子。在中性pH的水溶液中，其对苯基磷酸酯二价阴离子（PH-OPO32-）的Kd值为25 nM* (*：在Zn2+的情况下)。可用于磷酸化蛋白的特异性分离以及WB方法对磷酸化蛋白的检测（Phosbind Biotin）。

Phosbind SDS-PAGE工作原理图

特点：

1. 可识别Ser/Thr/Tyr的所有磷酸化形式，且没有物种特异性。
2. 可适用于免疫印迹和质谱分析等后续操作。
3. 可用总抗体而非抗磷酸化蛋白的抗体即可同时检测磷酸化和非磷酸化的蛋白。
4. 操作简便：在制备SDS-PAGE凝胶时只需在丙烯酰胺溶液中简单加入Phosbind Acrylamide和MnCl2溶液即可。