CAR-T疗法体外制备要先采集T细胞、改造基因、扩增再回输，流程长、成本高，还可能引起细胞因子释放综合征与神经毒性。体内CAR-T疗法通过病毒或非病毒载体，把CAR基因直接递送进体内T细胞。然而，这些CAR-T疗的目标主要是血液和淋巴组织里的T细胞。改造后的细胞难以穿透致密瘤体，容易在免疫抑制微环境里耗竭。正因为如此，此前也没有体内生成CAR-T成功治疗实体瘤的报道。

近日华南理工大学的研究团队设计出带有aCD3与aPDL1磁性纳米颗粒（M-BiNanoAb），把CART所需的抗体直接锚定到T细胞表面，生成CAR-T模拟细胞，再通过外加磁场把这些T细胞送进肿瘤组织，克服了实体瘤浸润障碍，提供了一种可更换靶点、无需编辑基因的细胞治疗策略。

为了确认两种抗体能否稳定锚到磁性纳米颗粒上，研究人员通过合成β-环糊精修饰的磁性纳米颗粒、按不同投料比混入金刚烷修饰的用罗丹明B标记的抗CD3抗体（aCD3）与红色荧光染料Cy5（A8769）标记的抗PD-L1抗体（aPDL1），合成M-BiNanoAb，再用ITC检测亲和力、ELISA测载量与固定比例、DLS与TEM测粒径和形貌、纳米流式细胞术测双标颗粒、STORM超分辨显微术看抗体分布，检测结合亲和力、抗体装载量、水合粒径、双阳性颗粒比例与表面荧光分布。结果显示，改变投料比可调节表面抗体密度，按10∶0.5∶0.5投料比组装的颗粒尺寸均一、内部聚集多个磁性内核，绝大多数颗粒同时带两种抗体，两种荧光在颗粒表面均匀铺开。ITC结果显示，金刚烷修饰的aCD3与aPDL1对β-环糊精修饰的磁性纳米颗粒具有强结合亲和力。

为了判断M-BiNanoAb能否选择性结合T细胞并留在细胞表面，研究人员通过把小鼠脾脏T细胞与梯度浓度的M-BiNanoAb或IgG对照颗粒共孵育、用流式细胞术测结合、共聚焦显微镜观察Cy5（A8769）标记的颗粒与细胞的共定位、台盼蓝淬灭实验区分表面结合与内吞，并用小鼠血清稀释后测粒径与抗体保留，检测T细胞结合率、颗粒与细胞的共定位、表面滞留比例与血清中的稳定性。结果显示，M-BiNanoAb与T细胞的结合远高于IgG对照颗粒且随浓度升高。颗粒主要附着于细胞膜表面、几乎不内化，经血清稀释后粒径保持稳定，抗体保留良好。

为了验证静脉注射后能否直接在体内生成CAR-T模拟细胞，研究人员通过给小鼠尾静脉注射Cy5标记的M-BiNanoAb、采集不同时间外周血T细胞，用流式细胞术测带标记的细胞比例、共聚焦显微镜观察颗粒与细胞的共定位、捕获ELISA测细胞表面的aPDL1分子数，检测外周血中CAR-T模拟细胞的比例、颗粒定位与表面aPDL1装载水平。结果显示，带标记的T细胞比例随时间逐步升高，峰值时大部分外周血T细胞已被改造，共聚焦图像显示颗粒贴附在细胞表面，这些细胞携带足量aPDL1，可以识别PD-L1高表达的肿瘤细胞。

综上所述，金刚烷修饰的两种抗体都稳定锚定在β-环糊精修饰颗粒表面。颗粒经静脉注射后附着于外周血T细胞膜，无需内化或进行基因修饰，从而将普通T细胞原位改造为表面表达aPDL1的CAR-T模拟细胞。颗粒连同其内部磁性内核滞留于细胞表面，因而只有外加磁场才能将这些细胞引导至肿瘤部位。

为了检验改造后的T细胞能否特异性识别肿瘤细胞，研究人员通过把CFSE标记的脾脏T细胞分成PBS、IgG对照颗粒、混合仅含aCD3或aPDL1颗粒的单特异性颗粒混合组、M-BiNanoAb、以及先用M-BiNanoAb再用重组PD-L1蛋白封闭五组，与IFN-γ刺激后高表达PD-L1的eFluor标记B16-F10细胞共孵育，用流式细胞术测双阳性细胞比例、CLSM计数黏附在肿瘤细胞上的T细胞，并另设浓度梯度组，检测T细胞与肿瘤细胞的结合率、每视野黏附细胞数与剂量依赖关系。结果显示，只有M-BiNanoAb组有大量T细胞贴附到肿瘤细胞上，加入重组PD-L1后黏附几乎消失，PBS、IgG对照颗粒与单特异性颗粒混合组都很少结合，且结合率随M-BiNanoAb浓度升高。

为了判断aCD3是否向T细胞传递了活化信号，研究人员通过把纯化的CD8+T细胞与不同浓度的M-BiNanoAb共孵育后，再与IFN-γ刺激的B16-F10细胞共培养，用流式细胞术测CD69阳性细胞比例、ELISA测上清中IFN-γ、TNF-α与颗粒酶B，检测T细胞活化比例与效应分子释放量。结果显示，M-BiNanoAb浓度越高，活化的CD8+T细胞越多，三种效应分子的释放量都明显高于对照颗粒组。

为了测定改造后T细胞的杀伤能力，研究人员通过按不同效应细胞与靶细胞比例、以及不同M-BiNanoAb浓度，把CAR-T模拟细胞与B16-F10细胞共培养，用LDH释放实验测肿瘤细胞裂解率，并用单特异性颗粒混合组作对照，检测靶细胞死亡比例、效靶比依赖性与浓度依赖性。结果显示，肿瘤细胞杀伤效果随着效靶比和M-BiNanoAb浓度升高，在选定的效靶比下多数肿瘤细胞被裂解。混合组虽能活化T细胞，却无法把两类细胞连在一起，杀伤明显偏弱。

综上所述，aPDL1通过结合肿瘤细胞表面的PD-L1完成识别，把T细胞锚到肿瘤细胞上；同一颗粒上的aCD3交联CD3，向T细胞传递活化信号。识别与活化必须由同一颗粒同时提供，T细胞才能裂解肿瘤细胞。

为了验证磁场能否牵引CAR-T模拟细胞定向移动，研究人员通过在Transwell下室放置钕铁硼磁铁、用流式细胞术计数穿过膜的细胞并计算迁移指数，再用Ibidi微流控趋化板在右侧建立磁场梯度、用转盘共聚焦显微镜（CLSM）连续记录细胞轨迹，统计运动速度、累积位移与右侧储液池的细胞数，检测迁移指数、运动方向、速度、位移与定向富集程度。结果显示，不加磁场时各组穿膜细胞都少，加磁场后迁移指数大幅升高，细胞沿磁场梯度持续单向移动，速度与位移明显增加，右侧储液池聚集的细胞远多于无磁场组。

为了排除血流剪切力对磁导向的干扰，研究人员通过用注射泵驱动细胞悬液流过三出口微流控腔、在最右侧出口旁放置磁铁，分别收集三个出口的流出液并用流式细胞术计数，同时把回收的细胞重新培养，测增殖与IFN-γ、TNF-α分泌，检测各出口细胞分布、磁导向富集程度与迁移后细胞功能。结果显示，无磁场时天然T细胞与改造细胞均匀分散到三个出口，加磁场后改造细胞集中到靠近磁铁的出口，磁导向没有削弱细胞增殖与细胞因子分泌。

为了确认磁导向带来的浸润能转化为更强杀伤，并检验平台能否更换靶点，研究人员通过在Transwell上室放CAR-T模拟细胞、下室放B16-F10细胞，在下室加磁铁后用LDH释放实验测肿瘤细胞裂解率，另用抗HER2/neu抗体替换aPDL1组装M-BiNanoAb，与HER2/neu阳性的乳腺癌细胞共培养，检测有磁场与无磁场时的杀伤率以及换靶点后的杀伤率。结果显示，加磁场后穿过膜并裂解肿瘤细胞的比例明显升高，换用抗HER2/neu抗体的颗粒在磁导向下仍能高效杀伤靶细胞。

为了查明磁场能否在活体内把改造细胞送进肿瘤，研究人员通过给荷B16-F10瘤的C57BL/6小鼠静脉注射M-BiNanoAb、把磁铁贴在瘤体表面，按时间序列取肿瘤，用流式细胞术计数CD3+与CD8+T细胞、免疫荧光（IF）染色观察CD8+T细胞的分布，另用S1P受体拮抗剂FTY720阻断T细胞自发迁移后再比较加磁场与不加磁场的浸润量，检测瘤内T细胞数量、浸润的时间变化、组织分布与磁导向对自发迁移的独立性。结果显示，加磁场后瘤内两类T细胞都明显增多并逐步达到峰值，IF显示CD8+T细胞深入肿瘤组织。FTY720几乎清空单用M-BiNanoAb组的瘤内T细胞，补加磁场又把浸润恢复到原有水平，4T1模型结果一致。

综上所述，外部磁场可以牵引带有磁性内核的CAR-T模拟细胞逆血流迁移并进入致密瘤体，瘤内T细胞增多来自磁场引导，不依赖细胞自身的趋化，独立于T细胞的自发迁移通路。磁导向不削弱细胞增殖与细胞因子分泌，进入肿瘤的细胞随即提高杀伤，更换锚定抗体即可改换靶点。

为了评价磁场引导CAR-T模拟细胞的整体疗效与安全性，研究人员通过把荷B16-F10黑色素瘤小鼠随机分成PBS、IgG对照颗粒、单特异性颗粒混合组、M-BiNanoAb、M-BiNanoAb加磁场五组，按疗程静脉给药并在瘤体贴磁铁，用游标卡尺记录肿瘤体积、称量终点瘤重、记录体重，并按时间序列测血清细胞因子，检测肿瘤生长曲线、抑瘤程度、瘤重、体重变化与炎症反应持续时间。结果显示，单特异性颗粒混合组仅轻微抑制肿瘤，单用M-BiNanoAb后期出现肿瘤再生，加磁场组肿瘤生长几乎被完全抑制、终点瘤重最低。各组体重没有明显下降，细胞因子只短暂升高后自行回落。

为了明确疗效提高的来源，研究人员通过取治疗后肿瘤组织，用流式细胞术与IF测CD8+T细胞与活化T细胞数量、ELISA测瘤内IFN-γ与TNF-α，并在FTY720（A8548）阻断自发迁移的条件下重复疗效实验，检测瘤内杀伤性T细胞蓄积、活化比例、效应细胞因子水平与磁导向对疗效的贡献。结果显示，加磁场组瘤内CD8+T细胞与活化T细胞明显增多，两种促炎细胞因子升高。即使FTY720（A8548）限制了T细胞自发迁移，磁导向组仍保持较强抑瘤效果。

为了检查磁驱动改造是否同时缓解T细胞耗竭，研究人员通过用多色流式细胞术分析治疗后瘤内T细胞亚群，检测PD-1、TIM-3阳性的耗竭细胞，Foxp3+的调节性T细胞（Treg），以及干细胞样T细胞（TCF-1+T细胞）与Ki67+的增殖细胞比例。结果显示，加磁场组耗竭细胞与Treg明显减少，TCF-1+T细胞与增殖细胞明显扩增。

为了检验策略对免疫细胞稀少的肿瘤是否同样有效，研究人员通过在4T1原位乳腺癌小鼠中重复五组给药，记录肿瘤体积、终点瘤重、体重、生存期与肝肾功能指标，并用多色流式细胞术分析瘤内T细胞亚群，检测抑瘤效果、生存获益、器官毒性以及CD8+、活化、效应分子、TCF-1+T细胞与耗竭细胞的比例。结果显示，加磁场组抑制肿瘤最明显并显著延长生存，部分小鼠存活超过观察期。各治疗组体重与肝肾功能指标同对照组相近；原本缺少T细胞的肿瘤里CD8+T细胞、IFN-γ+与TNF-α+细胞、GZMB+细胞和TCF-1+T细胞增多，PD-1、TIM-3、TIGIT标记的耗竭细胞减少。

综上所述，磁导向把更多CAR-T模拟细胞送进肿瘤，瘤内CD8+T细胞与活化细胞随之扩增，抑瘤效果由此提高，疗效主要来自磁导向带来的浸润。aPDL1同时占据PD-L1，阻断PD-1/PD-L1通路，耗竭细胞与Treg减少，TCF-1+T细胞与增殖细胞扩增，免疫细胞稀少的肿瘤因此也可以被清除。

为了检验杀伤肿瘤后能否把免疫应答扩展到更多抗原表位，研究人员通过建立稳定表达卵清蛋白（OVA）的B16-F10-OVA肿瘤模型，给小鼠注射M-BiNanoAb并在瘤体贴磁铁，用多色流式细胞术分别检测肿瘤组织与引流淋巴结中呈递SIINFEKL肽的树突状细胞（DC）和OVA特异性的CD8+T细胞，同时记录肿瘤生长，检测抗原呈递细胞（APC）比例、特异性T细胞比例与抑瘤效果。结果显示，加磁场组肿瘤生长被明显抑制，瘤内与引流淋巴结里呈递该抗原肽的DC和OVA特异性CD8+T细胞都显著增多。

为了验证能否形成持久的免疫记忆，研究人员通过先给荷4T1瘤小鼠完成M-BiNanoAb加磁场治疗并手术切除肿瘤，再向乳腺脂肪垫重新接种4T1细胞，用多色流式细胞术分析脾脏效应记忆T细胞与中央记忆T细胞，检测二次肿瘤发生率、无瘤小鼠数与记忆T细胞比例。结果显示，经治疗的小鼠几乎不再长出二次肿瘤，部分小鼠完全无瘤，脾脏两类记忆T细胞都明显扩增。

综上所述，肿瘤细胞裂解后释放胞内抗原，DC摄取并呈递这些抗原，把免疫应答从PD-L1扩展到更多表位，肿瘤组织与引流淋巴结里由此出现抗原特异性T细胞。这些T细胞分化为记忆细胞，机体再次遇到同种肿瘤细胞时便能迅速清除。

M-BiNanoAb由β-环糊精修饰磁性纳米颗粒与金刚烷修饰的aCD3、aPDL1组装而成。静脉注射后M-BiNanoAb直接结合外周血T细胞，将T细胞改造为带有抗体的CAR-T模拟细胞。aPDL1识别PD-L1高表达的肿瘤细胞，aCD3交联CD3传递活化信号，两者将T细胞与肿瘤细胞桥接并触发杀伤，更换锚定的抗体即可改换靶点。aPDL1同时占据PD-L1，阻断PD-1/PD-L1通路，减轻T细胞耗竭。颗粒的磁性内核被外加磁场吸引，将这些细胞引导至肿瘤并穿透致密瘤体。肿瘤裂解释放抗原，诱导DC呈递与抗原特异性T细胞扩增，并形成记忆T细胞，使小鼠抵御再次接种。本研究提供了一种可更换靶点、无需基因改造的CAR-T细胞治疗策略，并以磁场引导克服实体瘤浸润障碍。