萤光素酶技术应用 | 第一弹

小动物活体成像全流程详解

小动物活体成像主要包括光学成像、核磁共振成像、核素成像、超声成像和计算机断层摄影（CT）。其中最常用的光学成像主要采用生物发光与荧光成像两种方法。

生物发光是基于萤光素酶的发光。编码萤光素酶的基因可以通过稳定转染到细胞内以表达萤光素酶。当细胞分裂和分化时，萤光素酶也会得到持续稳定的表达，且发光强度和细胞数量成正相关。

而荧光成像则是通过荧光染料标记后成像。近年来，生物发光成像因其独特的优势而被广泛应用于小动物活体成像。

生物发光成像的优势

无自发荧光干扰

生物发光不像荧光那样需要激发光，所以不存在激发光引起的组织非特异性信号，检测信噪比更高

无需剃毛或提前禁食

荧光成像时毛发或饲料也可能会引起非特异性荧光信号，所以需要进行处理，而生物发光无需激发光所以可以不需要这些处理

灵敏度高

生物发光可检测低至数百个细胞，比荧光成像灵敏度更高

检测深度高

因为生物发光成像的灵敏度更高，所以对于需要深部成像的检测（检测深度3-4 cm），生物发光成像更适合

可进行精确定量

发光强度与细胞数量成良好的正相关，可用于定量。而荧光强度受到许多因素影响，使得其较难定量

生物发光VS荧光

（引自T.L. Troy, et al. (2004). Molecular Imaging 3:9-23）

生物发光活体成像实验流程

1. 确定使用的萤光素酶

常见的萤光素酶有萤火虫萤光素酶（Firefly luciferase，Fluc），海肾萤光素酶（Renilla luciferase，Rluc），Gaussia萤光素酶。它们在特定的条件下都可以催化各自的底物发出对应的光，这个过程无需激发器激发。其中，Fluc是使用最广泛的萤光素酶。这里我们就选择它为大家介绍其活体成像应用全流程。

2.构建稳定表达萤光素酶的细胞株

小动物活体成像的主要应用之一就是表征肿瘤细胞在体内的生长情况，此时需要构建可以稳定表达萤光素酶的肿瘤细胞。

将带有Fluc基因的载体通过转染试剂以一定手段转入研究的肿瘤细胞中，并通过筛选得到稳定表达Fluc的稳转细胞株。同时为满足稳转株筛选需求，载体需要带有至少一个抗性基因（如Neo）。此外为了表达更多的萤光素酶，建议可以选择带有强启动子的载体，如携带CMV启动子。载体可以自行构建，也可以选择商业化的载体。

3.验证稳转株

构建得到稳转株后，可以进行体外实验以验证Fluc稳转株效果。可以将生长良好的Fluc细胞消化，随后用培养基稀释成系列梯度浓度并分别接种于96孔板中，每孔100 μL，每个浓度设置三平行孔。检测时可以选择两种方式进行：

1) 用无菌的DPBS (不含钙镁离子) 配制15 mg/mL的D-Luciferin钾盐储存液，混匀后用0.2 μm滤膜过滤除菌备用。检测时去除孔内培养基，加入稀释的D-Luciferin钾盐溶液（如150 μg/mL），孵育3-5 min后通过小动物活体成像仪（如IVIS）测定各孔的发光强度。

2) 也可以通过报告基因检测试剂盒进行检测。此时细胞被裂解，获得的信号强度一般会比直接加入底物检测更高。

Tips：

• Fluc常见的底物为D-Luciferin。目前市面D-Luciferin有三种常见形式：游离形式，钾盐形式和钠盐形式。推荐使用钾盐形式进行活体成像实验，因为钾盐形式水溶性好，且文献使用更多。

• 因为钙镁离子可能会影响萤火虫萤光素酶的活性，所以建议直接使用不含钙镁离子的DPBS或PBS溶解底物。若无不含钙镁离子的DPBS或PBS，也可使用DPBS或PBS。

4. 稳转株注射动物

成功构建稳转株后，即可进行动物移植模型构建。此时一般是将Fluc细胞注射到小鼠体内。常见的实验操作如下：

1)准备细胞

收集处于对数生长期的Fluc细胞，用无菌的PBS清洗并重悬。然后调整至合适的细胞密度（如107 cells/mL）。制备好的细胞悬液置于冰上或4°C保存并尽快使用，不然影响细胞活力。

2)麻醉动物（可选）

可以根据选择的注射方法确定是否对小鼠进行麻醉。将准备好的动物进行麻醉，常见的注射麻醉剂有戊巴比妥钠、氯胺酮+塞拉嗪混合麻醉剂和阿福丁等。也可以使用气麻装置进行麻醉。

3)注射细胞

用注射器吸取细胞进行注射。

构建动物模型时需要注意以下几点，不然容易导致构建失败。

• 细胞

需要保证实验的细胞状态良好，一般可以选择对数生长期的细胞。同时需要注意，不同细胞系的成瘤能力不同，可以查找文献并参考对应细胞接种量。同时，如选择皮下注射，接种时可以加入一定基质胶以帮助成瘤。

• 小鼠选择

移植模型分为两种，同种移植（将小鼠肿瘤细胞移植给小鼠）和异种移植（将人源肿瘤细胞移植给小鼠）。同种移植需要使用和肿瘤细胞来源一致的小鼠，异种移植则需要选择免疫缺陷型小鼠，这样易于成瘤。同时小鼠的周龄不应太大或太小，一般选择为6-8周，体重18-22 g。如果异种移植时难以成瘤，也可以考虑降低周龄至4-6周。

• 麻醉

小鼠麻醉前一定要称重，并根据体重确定具体麻醉剂量。不当的剂量可能会导致小鼠死亡。同时小鼠麻醉后体温可能会下降，可以采取一定的保温措施，如电热毯或加热灯。

• 注射操作

注射时常用的注射方法主要有皮下注射、腹腔注射和尾静脉注射。前两种操作比较简单，注射时主要注意不要误伤小鼠器官。尾静脉注射对操作要求较高，注射前建议用热水浸泡小鼠尾巴以扩张静脉，同时可以准备一个简易装置固定小鼠，注射时可以选择离鼠尾远端约1/3的位置侧部静脉进针，这样注射的成功率更高。

5.注射底物

注射的细胞一般会在2-3周成瘤（具体时间根据细胞种类，接种数量，细胞活力会有所不同），可以根据实验设计进行一定处理（如给药）。成像前按以下操作进行注射底物：

1)一般可按照150 mg/kg的使用浓度对小鼠进行腹腔注射(i.p.)。例如，对于一只20 g重的小鼠，注射200 μL的15 mg/mL的D-Luciferin钾盐储存液，即使用10 μL/g的剂量。也可以根据实验需求选择其他注射方式，如尾静脉注射或皮下注射。

2)若选择腹腔注射，则推荐注射10-15 min (光信号达到最强稳定平台期)后进行成像分析。

6.活体成像

活体成像建议直接使用带有麻醉装置的小动物活体成像仪，这样操作更方便，而且可以更准确的控制小鼠麻醉的情况。如仪器不带麻醉装置，也可自行麻醉小鼠后置于小动物活体成像仪中进行成像。检测途中要注意防止小鼠中途苏醒而离开成像台。