选取对数生长期、状态饱满、无伪足、低传代（建议P10以内）的RAW264.7。用含10% FBS的α-MEM完全培养基重悬，计数。

以5×10⁴ cells/孔的细胞密度接种于24孔板。孔内可以放置无菌爬片以便后续染色。37°C、5% CO₂培养箱中静置培养。

细胞贴壁后（约接种后18 h），弃去培养基，更换含50 ng/mL M-CSF和100 ng/mL RANKL的α-MEM完全培养基继续培养。

之后每2-3天换液一次，换液时需要轻柔操作，再补加新鲜含有M-CSF和RANKL的α-MEM完全培养基。定期镜检以观察细胞形态变化，一般在RANKL诱导4天后可见少量融合多核细胞，第5-6天大量成熟破骨细胞形成，分化峰值期需及时开展染色、功能实验，放置过久多核破骨细胞会快速凋亡。

注

取4-7周龄C57BL/6小鼠（有报道雄性更佳），脱颈处死，置于75%乙醇中浸泡消毒5-10 min。

使用无菌眼科剪剥离股骨、胫骨，彻底剔除附着肌肉、结缔组织。将骨转移到超净台中，剪断两端骨骺，暴露出骨髓腔。

用1 mL注射器吸取α-MEM培养基或者无菌PBS反复冲洗骨髓腔，直至骨骼发白半透明，在6 cm培养皿中收集全部细胞悬液。

细胞悬液经40 μm细胞筛滤除组织碎片，随后转移至15 mL离心管中。

1000 rpm室温离心5 min，弃去上清。

加入红细胞裂解液重悬沉淀，冰上裂解10 min，离心后用PBS洗涤2次以去除裂解液残留。

用α-MEM完全培养基重悬细胞并接种于培养皿中，过夜培养以去除贴壁的杂细胞。

第二天收集未贴壁细胞，用扩增培养基（含25 ng/mL M-CSF的α-MEM完全培养基）重悬细胞后接种于培养皿中。

定期更换新鲜的扩增培养基，培养3-5天获得纯单核巨噬细胞（无杂细胞、无漂浮凋亡细胞）。

弃去培养基，用无菌PBS清洗1次。清洗后使用细胞刮刀收集细胞，离心后用新鲜的扩增培养基重悬细胞，计数并重新种板。

等细胞贴壁后，更换分化培养基（含25 ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANKL的α-MEM完全培养基）进行培养。每隔2天进行换液。

诱导3天后大量巨噬细胞会出现体积膨胀，随后部分细胞会融合成较大的巨细胞，内有多核。一般5-6天会出现大量的多核巨细胞。达到分化峰值后尽快完成后续检测，否则破骨细胞会大量凋亡。

注

细胞形态学：TRAP染色（最常用）

阳性破骨细胞判定标准

功能性鉴定：骨吸收陷窝实验（功能金标准）

分子标志物：基因/蛋白水平定量