1.简单总结

PCV的抗原设计并不是“预测若干高分表位后直接首尾相连”。 真正的设计对象是一个由抗原窗口、排列顺序、连接序列、表达骨架和递送平台共同决定的加工—呈递系统。

• 抗原数量：公开先例从每条mRNA编码5个抗原，到10、20、30、34、40和60个不等。数量增加可扩大克隆覆盖，但会同步增加接头数量、竞争性加工、免疫优势偏移和制造风险。

• 长肽（SLP）平台通常将每个抗原分别合成后混合，因此抗原之间没有物理Linker；mRNA、DNA和病毒载体将多段抗原编码在同一ORF中，连接区会被翻译，必须进行“接头新表位”风险控制。

• 短肽常规抗原：最常见的抗原单元是突变居中的20–35 aa长序列；BioNTech早期MERIT公开架构为27 aa、突变位于第14位，每条RNA串联5个抗原，抗原之间采用10 aa Gly/Ser-rich Linker。

• 常见Linker：常用候选包括无Linker、AAY、GGS/GS-rich、GPGPG、HHHH/组氨酸富集及AAL/丙氨酸型Spacer；应根据患者全部HLA等位基因同时优化抗原顺序与Spacer。

• 肿瘤的类型：高突变肿瘤（黑色素瘤、吸烟相关NSCLC、cSCC、膀胱癌）通常容易获得较多候选；低突变或免疫冷肿瘤（PDAC、HCC、卵巢癌、GBM）更强调高质量克隆性抗原、强递送/佐剂及MRD或术后应用场景。

2.现有PCV抗原串联方式与公开抗原数量

3. 抗原筛选：先保证抗原的质量，再讨论串联的数量

3.1 抗原窗口与串联单元

3.2 排序与Linker共优化

• 不要按抗原评分由高到低线性排列。每两个抗原形成两个方向（A→B、B→A），每个方向又可测试多种Spacer；这是组合优化问题。

• 对患者全部HLA-I和HLA-II等位基因扫描跨接头8–15 mer，筛除高亲和力接头binder、野生型相似肽及潜在优势表位。

• 优先保留能够同时满足：目标表位加工概率高、接头风险低、序列复杂度可控、整体ORF稳定的排序。

• 当无法在单一ORF中找到可靠方案时，应拆分为2条或多条RNA/质粒，或改为独立长肽池，而不是强行增加复杂Linker。

4.如何进行串联抗原设计： 推荐设计流程

提示：不建议按预测排名从高到低拼接，也不建议使用固定linker

建议：比较不同linker, 不同排序

5. 抗原之间的Linker/Spacer的设计与选取原理

5.1 为什么连接区不是“中性序列”

• 多表位ORF翻译后，蛋白酶体、内体/溶酶体和其他蛋白酶会同时切割抗原本体与连接区。跨越“抗原A—Linker—抗原B”的8–15 aa序列可能形成新的HLA结合肽。

• 若接头肽比目标突变肽具有更高的HLA结合和加工效率，免疫反应可能被接头表位或野生型侧翼占据，导致目标抗原免疫原性下降。

• 固定Linker还会产生重复核酸和重复氨基酸序列，可能增加DNA重组、RNA二级结构、IVT异常产物或翻译停顿。

• 因此，Linker选择必须与抗原排序、抗原窗口长度、递送路径及患者HLA共同设计。

5.2 常见Linker类型与风险对比

6.文献和公司临床前公开的PCV信息

7.PCV涉及的肿瘤类型、各自特点及设计差异

8.可直接执行的设计建议

• 数量决策：优先选择能覆盖主要肿瘤克隆且通过表达/呈递质量门槛的抗原；达到约15–30个后，新增低质量抗原的边际收益通常下降。

• Linker决策：先优化无Linker排序；若无解，再逐接头测试AAY、GGS/GS-rich、GPGPG及其他候选；每个接头可使用不同Spacer。

• 序列决策常规mRNA：在氨基酸架构确定后，再进行密码子与核酸工程；不得因密码子优化改变目标氨基酸窗口。

• 验证决策：至少保留2–3个不同Linker/排序的小规模构建，通过免疫肽组学和T细胞去卷积后再锁定临床构建规则。

• 常规mRNA ： 推荐起始架构为：10–30个长minigene，1–3条RNA；同时测试None、GS-rich、AAY、GPGPG；HLA感知排序。

9.常规mRNA多表位疫苗

mRNA疫苗在一个或多个ORF中编码多个突变中心序列。早期MERIT构建体使用两种RNA，每种编码五个27mer新抗原序列，突变位于残基14，小基因间为10 aa甘氨酸/丝氨酸-rich连接子。这种“五表位”架构旨在提供天然侧翼和I类/II类加工，同时使每个RNA保持在可管理的盒长度。现代商业产品扩展载荷：autogene cevumeran靶向最多20个新抗原，V940在单条合成mRNA中编码多达34个，但确切的患者水平顺序、连接子序列、UTR和运输元件未公开披露。

代表性披露架构（示意，非商业序列）： 5′帽 — 优化5′UTR — 信号/运输模块（平台依赖）— [27mer nAg1] — [10 aa GS-rich连接子] — [27mer nAg2] — ... — [27mer nAg5] — 运输结构域（可选）— 3′UTR — poly(A)

• 编码序列控制。 密码子优化应保留预期氨基酸窗口，同时避免长重复、隐蔽剪接位点、起始密码子附近强二级结构和不稳定基序。

• UTR和帽控制。 平台特定的帽化学、5′/3′UTR和poly(A)影响翻译持续时间和先天感知；这些元件通常为专有且跨患者固定。

• 抗原顺序。 顺序可改变翻译动力学、降解、加工和连接处表位。HLA感知的顺序优化优于线性排名。

• RNA数量。 多条较短RNA减少每分子盒长度并隔离困难序列，而单条RNA简化制剂和给药但增加连接处数量和结构复杂性。

10.平台与项目资料

① Intismeran autogene (V940/mRNA-4157; Moderna/Merck)

V940是一种患者特异性mRNA产品，由单条合成mRNA组成，编码从肿瘤突变谱中选择的多达34个新抗原。公开信息不披露确切的抗原窗口长度、顺序、连接子、UTR或编码序列。该产品在主要项目中与pembrolizumab联用；2b期切除高危黑色素瘤研究确立了随机概念验证，五年随访继续显示持久的RFS和DMFS分离。截至2026年7月，合作方报告了黑色素瘤、NSCLC、膀胱癌和肾细胞癌的9项2/3期研究，包括3期黑色素瘤和NSCLC项目以及高危I期NSCLC的3期研究。

② Autogene cevumeran (BNT122/RO7198457; BioNTech/Genentech-Roche)

Autogene cevumeran是一种个体化尿苷mRNA-脂质复合物免疫疗法，靶向最多20个新抗原。一项大型1期晚期实体瘤研究显示71%患者产生多表位CD4和/或CD8应答，应答可检测长达23个月。在切除的胰腺导管腺癌中，与atezolizumab和化疗联合的疫苗接种在部分患者中产生了持久的、高幅度新抗原特异性T细胞，推动了随机2期项目。确切的患者水平盒架构和连接子序列为专有。

③ MERIT个体化RNA突变组疫苗（学术/BioNTech前身）

2017年黑色素瘤研究提供了最清晰的公开序列架构之一。每名患者选择10个突变并工程化为两条合成RNA；每条RNA编码5个27mer肽，突变位于位置14，由10 aa甘氨酸/丝氨酸-rich非免疫原性连接子连接。该构建体还使用了优化的mRNA调控元件和运输特征。该设计有意为I类和II类加工提供天然侧翼，并确立了“五表位”先例。

④ GRANITE (Gritstone bio)

GRANITE设计为异源初免-加强PCV，编码20个新抗原：ChAd68载体初免（GRT-C901）后接自扩增mRNA/LNP加强（GRT-R902）。早期1/2期数据显示诱导新抗原特异性T细胞，一项随机2期研究评估了该方案在一线转移性微卫星稳定结直肠癌中的效果。确切的小基因顺序和连接子未公开。公司重组给长期项目连续性带来不确定性，应与科学数据分开看待。

附：已进入临床的PCV项目汇总