在上篇中，我们详细拆解了mRNA在线水解、脂质降解、mRNA-脂质加合物和颗粒物理重排等失效机制。理解了“为什么失活”之后，本篇将聚焦“如何稳定”，从热稳定性框架出发，沿mRNA分子工程、脂质化学设计、微环境控制、工艺优化和剂型选择五个层面，系统梳理可执行的稳定化策略。

 

3.热稳定性框架的启示

Jean H 最近的一篇综述将mRNA-LNP不稳定性分为mRNA化学稳定性、LNP脂质化学稳定性、LNP物理稳定性和mRNA-脂质加合物几个部分，并进一步将稳定化策略归纳为序列优化、核苷修饰、LNP脂质设计、缓冲液与pH优化、赋形剂、工艺优化、原材料质量控制、双瓶制剂、冻干/干燥技术、深共熔溶剂和物理应力研究等方向。该框架的重要价值在于，它把“冷链问题”从物流问题还原为分子运动和反应动力学问题：温度升高会同时加速mRNA水解、脂质水解、氧化、加合物形成和颗粒聚集。

从研发决策角度看，文章提示我们不要把稳定性目标简单设定为“从-80°C改为-20°C”，而应根据产品定位建立分层目标：短期临床样品可接受冷冻液体；常规疫苗产品应尽可能实现2-8°C长期稳定；全球化供应或应急储备则需要室温运输窗口或干燥制剂。

图2 提高mRNA疫苗/制剂热稳定性的技术路径

 

4. 稳定化策略一：mRNA分子工程，从源头降低降解概率

4.1 序列长度、GC富集与二级结构优化

在保证抗原构象和免疫表位功能的前提下，短mRNA通常更容易获得更高化学稳定性，因为单链上任意位点发生断裂都会使全长模板失效。序列设计可通过减少柔性单链环区、提高局部碱基配对比例、避免水解热点和优化UTR/编码区结构来降低在线水解概率。GC富集可增强双链区热力学稳定性，使2′-OH处于更受约束的构象，降低其对磷酸二酯键的攻击频率。

所谓“superfolder mRNA”思路并不是盲目追求更强二级结构，而是在不妨碍核糖体扫描、翻译起始和延伸的情况下，设计能减少未配对柔性位点的编码序列。对于疫苗抗原，尤其应同时评价体外表达、mRNA半衰期、RNase敏感性、储存后片段谱和体内免疫原性。

4.2 核苷修饰与可逆2′-OH保护

N1-甲基假尿苷等核苷修饰已广泛用于降低先天免疫激活并提升蛋白表达，但其对mRNA水解稳定性的直接改善有限，因为2′-OH仍然存在。更直接的策略是暂时保护2′-OH。例如，可逆2′-OH酰化可在细胞外储存阶段降低在线水解和核酸酶降解，在进入细胞后再通过自发或细胞内机制脱保护以恢复翻译活性。这类“可逆保护”策略仍需系统验证其脱保护动力学、翻译效率、杂质谱和免疫安全性，但代表了从化学层面解决mRNA稳定性的理性方向。

4.3 circRNA、分支poly(A)与端基保护

环状RNA通过去除5′和3′末端，可天然抵抗外切核酸酶攻击，并在某些应用中带来更长表达窗口。但circRNA的商业化仍面临环化效率、纯化、翻译元件选择、免疫识别和工艺一致性等挑战。分支poly(A)或末端结构改造可通过空间位阻降低去腺苷酸化和外切核酸酶进入，但其对LNP包封、释放和体内分布的影响需要与递送体系一起评价。

图3 分支型 Poly(A) 尾通过结构位阻有效抵抗外切酶降解，显著延长体内蛋白表达窗口

 

5. 稳定化策略二：脂质化学设计，降低LNP从保护者变成破坏者的概率

图4 mRNA或LNP-mRNA稳定化策略工具箱

开发的原则：稳定性不是单点优化，而是“mRNA序列、脂质结构、缓存体系、工艺”等的耦合设计；每一个策略都必须用效力、完整性、杂志和物理稳定性共同验证。

5.1 低醛生成可电离脂质：减少mRNA-脂质加合物源头

可电离脂质是LNP递送效率的核心，但也是稳定性风险的核心。叔胺型或含易氧化结构的脂质可能通过N-oxidation和后续裂解形成反应性醛类。Hashiba等的研究表明，通过设计更不易产生脂肪醛杂质的哌啶类可电离脂质，可改善mRNA-LNP在非冷冻条件下的热稳定性。这说明脂质筛选不应只看转染效率、pKa和毒性，还必须把醛生成倾向、N-oxide形成、加合物谱和长期效力保持纳入早期筛选。

图5 通过引入咪唑基团修饰的脂质（如 DOG-IM4），LNP 在常温下的结构稳定性得到显著提升，摆脱了对超低温冷链的依赖。

对于新脂质库，建议建立“效力-稳定性双筛选”流程：新鲜样品先测表达和细胞毒性；随后在4°C、25°C、37°C加速条件下监测mRNA完整性、RP-IP HPLC加合物、脂质氧化产物、粒径/PDI和表达衰减。只有同时具备高效递送和低反应性杂质风险的脂质，才适合作为临床前候选。

 

5.2 支链尾链、高微黏度与相态稳定

支链化可电离脂质能够增加LNP内部脂质相微黏度，限制脂质分子旋转和扩散，从而减缓氧化、重排和水相渗透。脂质尾链饱和度、链长、支化程度和连接臂共同决定膜包装密度和水通透性。需要注意的是，过度追求稳定包装可能降低内体逃逸效率，因此应以“储存稳定性-释放效率”的平衡为目标。

5.3 辅助脂质、胆固醇与PEG-脂质的结构选择

DSPC、DOPC、DOPE等辅助脂质在稳定性和效力上可能呈现不同取舍。一般而言，磷脂酰胆碱类辅助脂质可提升膜稳定性但有时降低效力；磷脂酰乙醇胺类脂质更有利于膜融合和内体逃逸，但化学和物理稳定性可能较弱。胆固醇通过增加脂质包装和降低膜通透性，可在一定程度上保护相邻脂质免受氧化和酯键断裂。PEG-脂质则需要在“制备阶段小粒径形成”和“储存/体内阶段锚定稳定”之间平衡，必要时探索长尾PEG-脂质、可降解PEG、两性离子聚合物或其他抗蛋白吸附材料。

 

6. 稳定化策略三：微环境、缓冲液与赋形剂

6.1 pH窗口与缓冲容量

mRNA水解对pH极其敏感；脂质水解、氧化和mRNA-脂质加合物形成也受pH影响。多数LNP-mRNA液体制剂会选择接近中性或弱中性的最终pH，以平衡生物相容性、可电离脂质质子化状态和mRNA化学稳定性。酸性过强可能诱导LNP相态变化和聚集；碱性过强则可能促进2′-OH去质子化和在线水解。

6.2 Tris、PBS与“醛清除”效应

缓冲体系不是惰性背景。Haensler等综述指出，辉瑞/BioNTech BNT162b2从PBS转向Tris体系后，复融后室温和2-8°C使用窗口均得到改善。Tris可能不仅提供pH缓冲，还可作为“醛汇”捕获反应性醛类，减少其与mRNA碱基形成加合物。但Tris并不必然在所有配方中提升长期物理稳定性：高浓度LNP研究中，Tris-蔗糖体系增强了体内外表达，却在部分冷藏条件下降低了物理稳定窗口。

6.3 抗氧化剂、螯合剂与原材料质量控制

微量Fe、Cu、Ni等过渡金属可催化脂质过氧化和ROS生成。EDTA等螯合剂可降低金属诱导氧化；α-生育酚、BHT等抗氧化剂可清除自由基，但其浓度和安全性需仔细优化，过量或配伍不当反而可能引发新的自由基反应。PEG原料、可电离脂质、胆固醇和磷脂均应建立过氧化值、酸值、醛类杂质、残留溶剂和金属离子质量标准。

 

7. 稳定化策略四：工艺过程决定LNP“出生结构”和储存命运

LNP的稳定性不是制备完成后才开始决定的，而是在乙醇相脂质和酸性水相mRNA快速混合的瞬间即被写入。流速比、总流速、脂质浓度、mRNA浓度、N/P比、混合器几何结构、酸性缓冲液种类、乙醇去除速度、TFF持液时间、温度和剪切历史都会影响粒径、内部结构、mRNA空间分布和后续稳定性。

7.1 快速混合平台期：避免粒径和批次漂移

在微流控或受限射流对冲混合中，总流速增加通常会使粒径下降，随后进入平台期。平台期意味着局部过饱和、成核和生长过程相对稳定，粒径不再对流速小幅波动高度敏感。工业放大应优先寻找并锁定这一平台期，而不是简单放大体积或提高速度。

7.2 TFF与持液时间：稳定性风险的隐藏来源

TFF用于去除乙醇、置换缓冲液和浓缩LNP，但也可能带来剪切、膜吸附、空气-液体界面和较长酸性/乙醇暴露时间。降低TFF初始体积、减少持液时间和避免过度剪切可降低脂质氧化、PEG脱落和颗粒聚集风险。高浓度起始物料的一个重要意义正是在于可减少TFF前浓缩步骤和缓冲液体积，从而缩短LNP暴露在潜在不利工艺环境中的时间。

7.3 机械应力、光照和包装系统

液体mRNA-LNP对振荡、摇晃、运输震动、冻融循环和空气-液体界面敏感。机械应力可导致PEG-脂质脱落、粒径增加、包封率下降和mRNA泄漏。包装开发应关注瓶型、灌装体积、顶空、硅油、玻璃/橡胶相容性、避光和低氧条件。最终产品应在真实包装形态下进行应力研究，而不是只测试散装中间体。

 

8. 稳定化策略五：剂型路线——冷冻、冷藏、冻干和双瓶制剂

8.1 冷冻液体制剂：短期可行但冷链依赖强

冷冻可显著降低反应速率，是第一代mRNA疫苗得以快速商业化的重要条件。但冻融会带来冰晶、局部浓缩、pH漂移和膜应力；反复冻融尤其容易造成粒径增大、包封率下降和表达损失。冷冻液体适合早期临床和对冷链要求可控的产品，但不是全球普惠的终极答案。

8.2 冷藏液体制剂：最具商业吸引力但难度最高

2-8°C液体制剂是常规疫苗供应链最希望实现的目标。要达到这一目标，需要同时降低mRNA水解、脂质水解、脂质氧化、加合物形成和物理聚集。低醛可电离脂质、pH窗口优化、Tris或组氨酸缓冲体系、EDTA/抗氧化剂、低氧避光包装和工艺低剪切控制必须集成设计。

8.3 冻干、喷雾干燥和薄膜冻干：用“去水化”降低反应网络

冻干通过升华去除水分，并用蔗糖/海藻糖等形成玻璃态保护矩阵，可显著降低水解和多数扩散控制反应。其挑战在于冻结和干燥阶段的膜应力、PEG缠结、复溶聚集、残余水分控制和工业产能。对于季节性或小批量产品，冻干可能是快速获得非冷冻储存窗口的有效路线；对于超大规模疫情疫苗，冻干成本和产能仍需评估。

8.4 双瓶制剂与深共熔溶剂：有潜力但需谨慎验证

双瓶制剂将mRNA和载体分开储存，可从根本上减少mRNA与脂质长期接触和加合物形成，适合应急储备或个性化疫苗场景。但混合均一性、剂量准确性、现场操作和监管接受度是难点。深共熔溶剂或天然深共熔体系可降低水活度并可能稳定核酸，但其与LNP形成、体内安全性、渗透压和残留风险仍处于早期探索阶段。