脂质纳米颗粒（LNP）作为mRNA递送的核心载体，mRNA-LNP技术已从新冠疫苗的成功应用拓展至肿瘤免疫、基因编辑等多个治疗领域。

现行工艺：现行主流商业工艺使用的脂质混合物浓度大多在25–50 mg/mL范围内，而学术研究中更普遍低于15 mg/mL。

高浓度LNP制剂：在工艺开发的过程中，会有研究人员进行高浓度的LNP制剂的探索。限制因素：但因为LNP制剂的成本过高，或条件限制，或数据保密的需要，高浓LNP制剂研究报道的数据不多。优势：提高起始脂质与mRNA浓度可减少有机溶剂用量、缩小缓冲液体积、缩短TFF浓缩时间，从而提升工艺效率，节约成本，减少LNP制剂因长时间暴露带来的氧化损伤。模糊点：高浓度是否会引发粒径增大（LNP颗粒异常堆积而引起寡聚）、包封率下降等质量等问题，不清楚。

最新研究：近期Shkodra等人的一项系统性研究挑战了传统认知，通过将脂质混合物浓度从常规的5–15 mg/mL大幅提升至70 mg/mL，并结合受限射流对冲混合技术，系统考察了高浓度条件对LNP理化性质、形态分布、体内外转染效率及六个月储存稳定性的影响。

LNP特征：70 mg/mL高浓度组仍可制备出粒径63–74 nm、PDI＜0.2的均一颗粒，且mRNA回收率较15 mg/mL组显著提高；冷冻电镜揭示高浓度促使实心核（Solid core）比例从约70%跃升至84%，伴随双相水泡结构（Bleb）的显著减少。

小鼠体内表达：小鼠体内实验中，45与70 mg/mL组在6 h的荧光素酶表达峰值明显高于低浓度组，且Tris‑蔗糖缓冲液通过赋予颗粒更高正电荷进一步放大了转染优势。

稳定性考察：长期稳定性方面，PBS缓冲液中70 mg/mL组在2–8°C可稳定保存180天，而同一配方在室温下稳定性急剧下降，Tris‑蔗糖组则在表达效能与物理稳定性之间呈现明显的折衷关系。

对工艺放大的意义：本文基于该研究的详细实验数据，系统梳理高浓度工艺强化的实验设计、关键结果及其对mRNA-LNP产业化开发的启示。

回看这篇研究：2026年发表于Pharmaceutics的研究，系统比较了低（15 mg/mL）、中（45 mg/mL）、高（70 mg/mL，该脂质组成在乙醇中的溶解度上限）三个浓度水平下LNP的理化性质、形态、包封效率、体内外表达及长达6个月的储存稳定性。

研究意义：从科研到小试工艺层面，向科研和工艺开发者展现高浓度LNP制剂实验设计，实验关键数据及工艺开发，制剂储存条件探究及稳定性等方面的重要数据，对高浓度LNP制剂开发具有指导意义。

 

实验设计： 脂质组成与LNP制备

研究选用Moderna Spikevax®的脂质组成：可电离脂质SM-102、胆固醇、辅助磷脂DSPC及PEG化脂质DMG-PEG2000，摩尔比为50:38.5:10:1.5。脂质混合物溶于乙醇，浓度分别设定为5、15、30、40、50、60、70 mg/mL（溶解度上限为70 mg/mL）。mRNA（Firefly luciferase mRNA，1921个核苷酸）或poly(A)（700–3500 kDa）作为模型载荷溶解于50 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 4.0）中，按N/P比（可电离脂质氮/mRNA磷酸）为6计算mRNA浓度。使用FR-JET®混合器，混合腔直径2 mm，水相针孔200 μm，有机相针孔100 μm，总流速（TFR）为30、60、80 mL/min，水相与有机相流速比（FRR）为3:1。制备后LNP在室温下分别对PBS（10 mM，pH 7.2）或Tris-蔗糖缓冲液（10 mM Tris，300 mM蔗糖，pH 7.2）透析过夜（MWCO 10 kDa）。

 

LNP表征：

• 粒径与PDI：动态光散射（DLS），Zetasizer，样品稀释至0.1 mg/mL。
  

• Zeta电位：电泳光散射，样品稀释于水中。

• 包封效率（EE%）与回收率：RiboGreen荧光法。

• 形态学：冷冻透射电子显微镜（cryoTEM），

• mRNA完整性：变性琼脂糖凝胶电泳（1%琼脂糖，SYBR Green染色）。

• 细胞活力：Alamar Blue法，HEK293细胞，LNP浓度5.5–44 μg/mL。

• 体外转染：ONE-Glo荧光素酶检测，HEK293细胞，mRNA浓度0.25–2 μg/mL，Lipofectamine 3000作为对照。

• 体内实验：BALB/c小鼠（每组5只），双侧肌内注射5 μg mRNA（DiR标记），IVIS活体成像检测荧光（biodistribution）和生物发光（luciferase expression），时间点0、6、24、48 h。

• 稳定性：6个月内测定粒径与PDI，储存温度2–8°C和20°C。

 

高浓度混合对粒径、包封率与回收率的影响

实验发现：在15–70 mg/mL脂质浓度范围内，所有TFR（30、60、80 mL/min）条件下制备的LNP粒径均保持稳定。以PBS透析组为例，15 mg/mL时粒径约66–69 nm，70 mg/mL时约63–74 nm，PDI始终低于0.2（表1）。这一结果挑战了“高浓度必然导致粒径增大”的传统观念，其自有混合器在高物料浓度下仍能实现快速均匀混合，避免局部过饱和引起的过度成核或聚集。

包封效率（EE%）：所有配方的EE%均在90%–95%之间，不同浓度间无显著差异，说明高浓度未损害脂质膜对mRNA的包裹能力。值得关注的是RNA回收率：15 mg/mL组仅约70%–86%，而45 mg/mL组提升至约88%–96%，70 mg/mL组同样维持在较高水平（约88%–95%）。回收率的提高意味着更少的mRNA在管路、透析膜或容器表面损失，直接降低了原料药成本。

工艺意义：高浓度起始物料直接产出更浓缩的LNP中间体（含25%乙醇），后续TFF步骤可省略或缩短初始浓缩阶段，仅需进行缓冲液置换。这减少了TFF膜面积和操作时间，也降低了LNP在膜表面的剪切损伤风险。

表1 不同脂质浓度LNP的粒径、PDI、EE%和回收率（PBS透析组，n=3）

（注：Tris-蔗糖组粒径略大，约91–104 nm，数据略）

 

CryoTEM形态学：浓度驱动实心核优势

• 15 mg/mL组：实心核比例约67%–71%，双相分裂结构占27%–32%。 

• 70 mg/mL组：实心核比例跃升至约84%，双相分裂降至约15%。 

 

分析与解释：高浓度脂质混合物在受限射流对冲下经历更强的剪切和更快的成核速率，脂质分子排列更为紧密，形成致密的实心核。实心核结构被认为有利于保护RNA免于水解，并可能通过更密集的PEG链排列减少颗粒聚集和免疫识别。此外，水泡（Bleb）结构的减少可能避免mRNA被困于隔离的水相腔室中，从而促进内吞后mRNA的胞质释放。这一形态重塑为后续转染效率的提升提供了结构基础。

图1 CryoTEM图像及形态分布直方图

 

体外转染（HEK293细胞）：高浓度与缓冲液的协同增效

• 在PBS透析组中，TFR 30 mL/min条件下，45和70 mg/mL组的荧光素酶表达在1–2 μg/mL mRNA浓度下显著高于15 mg/mL组（p＜0.05）；TFR 80 mL/min时，70 mg/mL组表达最高。

• 表达水平与zeta电位呈正相关：高浓度组LNP表面正电荷略高（PBS中15 mg/mL为-2～-3 mV，70 mg/mL为+3～+9 mV），增强了与带负电细胞膜的电相互作用。

 

缓冲液对比：

• Tris-蔗糖透析的LNP具有更高的正zeta电位（+10～+30 mV），而PBS组接近中性或微正电。在相同mRNA浓度下，Tris-蔗糖组体外表达量显著高于PBS组（p＜0.01，图2）。

• 作者推测，除表面电荷外，Tris-蔗糖中的蔗糖可能通过渗透压调节或保护LNP结构完整性间接提升转染。

 

体内小鼠实验（肌内注射）：

• 所有配方的生物发光信号在注射后6 h达到峰值。

• 浓度效应：在PBS组中，6 h峰值表达量：15 mg/mL组显著低于45和70 mg/mL组（p＜0.05及p＜0.01）。Tris-蔗糖组中，45和70 mg/mL组的峰值表达量均极显著高于15 mg/mL组（p＜0.0001）。

• 缓冲液效应：对于45和70 mg/mL配方，Tris-蔗糖透析组的6 h表达量极显著高于相应的PBS组（p＜0.0001），但对于15 mg/mL低浓度组，缓冲液选择无显著影响（p＞0.05）。

• 24 h和48 h后，高浓度组的表达优势仍维持，但差异逐渐缩小。

   

讨论：高浓度制备的LNP由于更高的mRNA载荷和更有利的表面电荷，在体内外均表现出增强的转染效力。Tris-蔗糖缓冲液进一步放大了这一优势，但仅在足够高的脂质浓度下才显现效应——提示高浓度是“放大器”发挥作用的前提条件。

图2 小鼠注射部位6、24、48 h荧光素酶表达（按浓度与缓冲液分组）

 

储存稳定性：效能与货架期的权衡

短期稳定性（Hold-time）：混合后未经稀释的LNP（含25%乙醇）在2–8°C或20°C下放置6 h，粒径和PDI均无明显变化，表明高浓度中间体可安全存放至少6 h，足以衔接下游TFF操作。

图3  LNP在2–8°C或20°C下放置6 h粒径和PDI均无明显变化

 

长期稳定性（6个月）：定期监测粒径（阈值≤120 nm）和PDI（≤0.25）。

• PBS透析组：
  

• 2–8°C：15 mg/mL稳定约60天；45 mg/mL稳定至少150天；70 mg/mL稳定180天（粒径95±6 nm，PDI 0.21±0.04）。

• 20°C：15 mg/mL稳定21天；45 mg/mL稳定60天；70 mg/mL仅稳定1天（72±8 nm，PDI 0.15±0.05）。

   

• Tris-蔗糖组：

• 2–8°C：15 mg/mL稳定21天；45 mg/mL稳定90天；70 mg/mL稳定28天。

• 20°C：15 mg/mL稳定7天；45和70 mg/mL均稳定28天。

   

 

关键结论：

• 高浓度（70 mg/mL）在冷藏条件下（2–8°C）显著延长了PBS中LNP的货架期，但在室温下反而加速失稳，可能与高浓度下颗粒间碰撞频率增加和表面水合层不足有关。

• Tris-蔗糖虽然大幅提升了转染活性，但其在冷藏条件下的物理稳定性普遍低于PBS，尤其在70 mg/mL高浓度时稳定性窗口缩短（仅28天）。这提示在制剂开发中需根据目标储存条件（冷链 vs. 冷冻 vs. 室温）权衡缓冲体系的选择。

• 蔗糖对冻融稳定性的积极影响已有大量文献支持，但在液态储存中并非总是有益。

图4  不同浓度与缓冲液下LNP在2–8°C及20°C的稳定时间图

 

对工艺开发的启示

本研究通过严谨的实验设计证明：利用高效的受限射流对冲混合技术（FR-JET®），将脂质起始浓度提升至70 mg/mL不仅可行，而且在颗粒质量、mRNA回收率、形态致密度和体内转染效率方面均优于或等效于传统的低浓度工艺。具体而言：

1. 工艺简化：高浓度直接产出浓缩中间体，可缩减或省去TFF初始浓缩步骤，减少设备规模和操作时间，同时降低有机溶剂暴露风险。

2. 成本节约：mRNA回收率从约70%提高至90%以上，对昂贵核酸原料的使用效率提升显著。

3. 质量提升：高浓度促使实心核比例增加，减少水泡结构，可能有利于RNA保护和细胞摄取。

4. 储存策略：若目标为2–8°C液体储存，PBS体系搭配70 mg/mL浓度可提供长达半年的稳定性；若追求最大体内活性且可接受较短的液体储存期或采用冷冻/冻干，则Tris-蔗糖体系更优。

 

局限性与未来方向

该研究主要基于poly(A)和Fluc-mRNA两种模型载荷，且仅考察了一种脂质组成（SM-102/胆固醇/DSPC/DMG-PEG2000）。不同可电离脂质、辅助脂质比例或PEG脂质碳链长度可能对高浓度工艺的耐受性不同，需要分别验证。