在上一篇中，我们详细拆解了LNP的经典四组分及其专利格局，并重点介绍了跨血脑屏障和脾脏靶向两大前沿策略。本文将继续聚焦第三个关键肝外靶器官——肺部，并附上完整的LNP配制计算过程，供大家在实际研发中参考。
研究三：通过调整LNP的组分实现在肺靶向的递送
常规四组分LNP（含SM-102/可电离脂质、磷脂DSPC、胆固醇、PEG脂质）主要靶向肝脏，难以高效、特异地将mRNA递送至肝外组织（如肺）。北大程强课题组等搭建新型脂质纳米颗粒（LNP）平台，利用协同靶向策略-将"电荷/结构驱动的组织趋向性LNP"与"抗体表面修饰（抗CD31）"相结合，将治疗性mRNA精准、高效地递送至肺部，显著提升了肺部疾病（如肺癌、肺纤维化、囊性纤维化等）治疗潜力与安全性。
图1. CD31抗体偶联的SynTar LNP系统
LNP设计与核心表征
基础肺靶向LNP（4C-DOTAP LNP）：摩尔比 SM-102 : Cholesterol : DOTAP : DSPE-PEG2000-Mal = 30 : 38.5 : 30 : 1.5（mol%），其中DOTAP占30%时肺靶向最佳。
SynTar LNP：在4C-DOTAP LNP基础上，通过DSPE-PEG-Mal末端的马来酰亚胺与抗小鼠CD31抗体发生巯基化学偶联，对PEG进行表面抗体化修饰（最优Mal:抗体摩尔比20:1）。
细胞实验与靶向效果
使用HEK 293T细胞经Lipofectamine 2000转染IL-15 superagonist mRNA，验证了蛋白体外表达；使用Ai14报告小鼠经静脉注射SynTar LNP递送Cre mRNA。结果显示：与4C-DOTAP LNP组相比，SynTar LNP使肺整体tdTomato⁺细胞比例从6.3%升至34.0%，其中肺内皮细胞（CD31⁺CD45⁻）从30.5%升至72.0%，肺上皮细胞（CD326⁺）从22.0%升至65.0%，免疫细胞（CD45⁺）从1.4%升至19.9%，而同型IgG修饰对照组无增强效应。
结果表明，SynTar LNP可通过CD31抗体介导的特异性靶向，高效递送mRNA至肺内皮、上皮及免疫细胞。与4C-DOTAP LNP组相比，大大降低脱靶效应，也大大降低了脱靶产生的细胞毒性。
图2. 不同LNP组分的肺靶向分布及效果
小鼠实验及结果分析
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实验动物：
- C57BL/6J小鼠（6–10周）
- Ai14 (R26-LSL-tdTomato) 报告小鼠：用于Cre mRNA介导基因编辑检测LNP转染效率与细胞类型
- B16或LLC模型：LLC-Fluc肺癌采用C57BL/6J尾静脉接种建模范本
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注射方式及剂量：
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尾静脉注射（i.v.） -
萤光素酶mRNA（fluc mRNA）：常用剂量 0.1–1.0 mg/kg（SynTar最低有效剂量0.5 mg/kg即等同1.0 mg/kg 5C-DOTAP效果） - Cre重组酶mRNA：同等体积尾静脉注射，分析5天后取器官
- IL-15 superagonist mRNA SynTar LNP：0.5 mg/kg，于荷瘤后Day 3单次或按方案给药
图3. SynTar-LNP系统介导的IL-15 Superagonist mRNA的表达
主要结果分析
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组织分布（fluc/Cre）：SynTar LNP肺部荧光信号较4C-DOTAP LNP提高约3倍，较PBS提高32倍；肝/脾脱靶显著低于单纯抗CD31-LNP（Anti LNP）及5C-DOTAP LNP。肺/肝、肺/脾比值显著提高。
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肺癌治疗实验（LLC-Fluc i.v.转移性肺癌模型）：
Day 0：尾静脉接种1×10⁶ LLC-Fluc细胞
Day 3：分组给PBS / Cre SynTar LNP / IL-15sa SynTar LNP（0.5 mg/kg）
结果：IL-15sa SynTar LNP组肺部生物发光信号较对照降低约12倍，离体肺瘤结节减少约20倍，肺重量正常（提示低瘤负荷），中位生存期从PBS组20天延长至35天。流式显示肺及外周血NK细胞显著激活（肺NK由5.1%→21.7%），肺CD8⁺ T细胞浸润增多（IHC证实）。
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平台普适性验证：CD31偶联的SynTar LNP肺表达较未修饰LNP提升>4倍，肺特异性由90%提升至96%。
该研究主要集中在肺靶向LNP的筛选上，除了优化LNP的组分，使其靶向或更多富集在肺部，还通过肺部特异性抗体CD31偶联PEG的方式,进一步将LNP靶向肺部，即双靶向的方式，降低了脱靶的效率带来的毒副作用，也降低了使用剂量，实现了高效、特异、安全的肺部mRNA递送。用抗体CD31偶联传统肺靶向DOTAP LNP递送IL-15超级激动剂mRNA可在肺癌肺转移模型中激活NK/CD8⁺ T细胞、显著抑制肿瘤生长并延长生存，证明其作为肺部mRNA治疗平台的潜力。
其它优化LNP递送的策略，比如添加第五种SORT脂质，通过改变SORT脂质的电荷性质和比例，精确调控LNP的器官生物分布等就不在此处进行详述，通过这些研究案例，为大家提供一个可以进一步探究的方向，同时也说明LNP筛选的下一个重要的风向标就是用更优的LNP系统来实现核酸药物的精准的靶向递送。
LNP制剂中各组分比例计算及配制
最后根据文献等公开信息，以辉瑞/BioNTech新冠疫苗BNT162b2中使用的经典的4组分LNP脂质及摩尔比率为例，说明以下如何进行脂质组分间以及与mRNA之间的配置。首先需要考虑LNP包封的总脂质摩尔浓度，常用的浓度为8mM, 12mM, 16mM；其次考虑氮磷比（N/P）比，即代表正电荷的阳离子脂质与带负电荷的mRNA分子的比例，常用的N/P为4、6或8。
第一步：计算各组分脂质质量
1L体积下1mM 总脂质对应的4种脂质的质量，以可电离阳离子脂质ALC-0315(分子量 MW:766.3)为例， 总脂质摩尔数为1mM时，4组分中摩尔占比为46.3%的脂质ALC-0315摩尔数为0.463mM，质量为0.453 X766.3=354.8mg， 即配制总体积1L浓度为1mM脂质混合物，所需要ALC-0315的质量为354.80mg。实际情况下，根据配制的体积， 总脂质浓度（8mM、12mM、16mM）进行等比例放大。
以下是按在1L体积下脂质分子配制的表格，供参考
第二步：计算mRNA的用量
按照BNT162b2中使用N/P=6， 首先确定氮（N）的来源为阳离子脂质ALC-0315，每个分子含一个N原子，因此 N的摩尔数=ALC-0315摩尔数=0.463 X 总脂质摩尔数；其次磷（P）的来源为mRNA中的磷酸基团，每一个碱基包含一个磷酸根，因此P的摩尔数=mRNA摩尔数。所以每mol总脂质包封mRNA摩尔数=（0.463 X1）/(N/P)。
以脂质浓度=8 mM、N/P=6为例，每升脂质包封的mRNA摩尔数为，0.463×8×10(-3)/6=0.6173×10(-3) mol。RNA脱水聚合后的平均分子量均值为320.5 g/mol，那么，每升脂质包封的mRNA质量为0.6173×10(-3)×320.5 (g)=197.85 mg；结合常用的水相（mRNA）与乙醇相（脂质）的流速比为3: 1，每升脂质对应消耗3 L mRNA，计算得到mRNA的浓度为65.95 mg/L，等同于65.95 ng/μL。
以BNT162b2疫苗中N/P=6 （或8）条件下脂质摩尔数对应的mRNA浓度
LNP-mRNA的包封是mRNA成品制备中的关键步骤之一，其中脂质和mRNA用量的计算和样品准备较为繁琐。上述以辉瑞/BioNTech疫苗中阳离子ALC-0315为基础的LNP为例，整理了各脂质用量以及对应mRNA用量的计算思路，以供参考。
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